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1、基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗能够在比较短的时间从理论设想变为现实，主要是由于 分子生物学的理论及技术方法，特别是重组DNA技术的迅速发展，使人们可 以在实验室构建各种载体、克隆及分析目标基因。所以对疾病能够深入全分 子水平的研究，并已取得了重大的进展。因此在20世纪70年代末诞生了基 因诊断(gene diagnosis)；随后于1990年美国实施了第一个基因治疗(gene therapy )的临床试验方案。可见，基因诊断和基因治疗是现代分子生物学的 理论和技术与医学相结合的范例。基因诊断o基因诊断的含义传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，如患者的症状、血尿各 项指标的变化，
2、或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是 特异的，而且是在疾病发生的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确 的诊断。现知各种表型的改变是由基因异常造成的，也就是说基因的改变是 引起疾病的根本原因。基因诊断是指采用分子生物学的技术方法来分析受检 者的某一特定基因的结构(DNA水平)或功能(RNA水平)是否异常，以此 来对相应的疾病进行诊断。基因诊断有时也称为分子诊断或DNA诊断(DNA diagnosis)。基因诊断是病因的诊断，既特异又灵敏，可以揭示尚未出现症 状时与疾病相关的基因状态，从而可以对表型正常的携带者及某种疾病的易 感者作出诊断和预测，特别对确定有遗传疾病家族史的个体
3、或产前的胎儿是 否携带致病基因的检测具有指导意义。o 基因诊断的原理及方法(一) 基因诊断的原理疾病的发生不仅与基因结构的变异有关，而且与其表达功能异常有关。基因 诊断的基本原理就是检测相关基因的结构及其表达功能特别是RNA产物是否 正常。由于DNA的突变、缺失、插入、倒位和基因融合等均可造成相关基因 结构变异，因此，可以直接检测上述的变化或利用连锁方法进行分析，这就 是DNA诊断。对表达产物mRNA质和量变化的分析为RNA诊断(RNA diagnosis)。(二) 基因诊断的方法基因诊断是以核酸分子杂交(nucleic acid molecular hybridization)和聚 合酶链反
4、应(PCR)为核心发展起来的多种方法，同时配合DNA序列分析， 近年新兴的基因芯片可能会发展成为一种很有用的基因诊断方法。 DNA诊断常用检测致病基因结构异常的方法有下列几种。斑点杂交：根据待测DNA样本与标记的DNA探针杂交的图谱，可以判断目 标基因或相关的DNA片段是否存在，根据杂交点的强度可以了解待测基因的 数量。等位基因特异的寡核苷酸探针(allele-specific oligonucleotide probe, ASO probe)杂交：是一种检测基因点突变的方法，根据点突变位点 上下游核苷酸序列，人工合成约19个核苷酸长度的片段，突变的碱基位于 当中，经放射性核素或地高辛标记后可
5、作为探针，在严格杂交条件下，只有 该点突变的DNA样本，才出现杂交点，即使只有一个碱基不配对，也不可能 形成杂交点。一般尚合成正常基因同一序列，同一大小的寡核苷酸片段作为 正常探针。如果受检的DNA样本只能与突变ASO探针，不与正常ASO探针杂 交，说明受检二条染色体上的基因都发生这种突变，为突变纯合子；如果既 能与突变ASO探针又能与正常ASO探针杂交，说明一条染色体上的基因发生 突变，另一条染色体上为正常基因，为这种突变基因的杂合子；如果只能与 正常ASO探针杂交，不能与突变ASO杂交，说明受检者不存在该种突变基因， 如图21-1所示。若与PCR方法联合应用，即PCR/ASO探针杂交法(P
6、CR/ASO probe hybridization)，是一种检测基因点突变的简便方法，先用PCR方法扩增突 变点上下游的序列，扩增产物再与ASO探针杂交，可明确诊断突变的纯合子 和杂合子。此法对一些已知突变类型的遗传病，如地中海贫血、苯丙酮尿症 等纯合子和杂合子的诊断很方便。也可分析癌基因如H-ras和抑癌基因如p53 的点突变。单链构象多态 性 (single strand conformation polymorphism, SSCP) 分析相同长度的单链DNA因其序列不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象 不尽相同，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时速度就不同，若单链DNA用放射 性核素标记，
7、显影后即可区分电泳条带。一般先设计引物对突变点所在外显 子进行扩增，PCR产物经变性成单链后进行电泳分析。PCR/SSCP方法，能快 速、灵敏、有效地检测DNA突变点，如图21-2，此法可用检测点突变的遗传 疾病，如苯丙酮尿症、血友病等，以及点突变的癌基因和抑癌基因。 限制性内切酶图谱(restriction map)分析，如果DNA突变后改变了 某一核酸限制性内切酶的识别位点，使原来某一识别位点消失，或形成了新 的识别位点，那么相应限制性内切酶片段的长度和数目会发生改变。一般基 因组DNA经该种限制性内切酶水解，再做Southern印迹，根据杂交片段的 图谱，可诊断该点突变，如图21-3所示
8、。如果用PCR扩增该突变点的外显 子，PCR产物经该种酶消化后，进行琼脂糖电泳，漠乙锭染色后可直接观察 片段的大小及数目。此法可用于检测有些限制性内切酶识别位点消失的遗传 疾病，如镰状细胞贫血。或基因缺失的疾病如a地中海贫血症，单纯性生 长激素缺之症等。限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism ,RFLP)遗传连锁分析人群中个体间DNA的序列存在差异，据 估计每100-200个核苷酸中便有1个发生突变，这种现象称为DNA多态性。 有些DNA多态性可改变某一限制性内切酶的识别位点，因而产生了 DNA限制 性片段长度多态性。RFLP按孟
9、德尔方式遗传，在某一特定的家庭中，如果某 一致病基因与特定的多态性片段连锁，可以遗传给子代，因此这一多态性片 段可作为遗传标记，来判断该家庭成员或胎儿的基因组中是否携带该致病基 因，见图21-4,此法可用于诊断甲型血友病、苯丙酮尿症、享延顿舞蹈病等。DNA序列分析对致病有关的DNA片段进行序列测定，是诊断基因异常(已 知和未知)最直接和准确的方法。RNA诊断RNA诊断主要是分析基因的表达功能，检测转录物的质和量，以判断基因转 录效率的高低，以及转录物的大小。(l)RNA印迹(Northern blot)RNA印迹是检测基因是否表达，表达产物mRNA 的大小的可靠方法，根据杂交条带的强度，可以判
10、断基因表达的效率。RT-PCR是一种检测基因表达产物mRNA灵敏的方法，若与荧光定量PCR结 合可对RT-PCR产物量进行准确测定。o基因诊断的应用(一) 遗传疾病现知遗传疾病有数千种，但多数遗传疾病属少见病例，有些遗传疾病在不同 民族，不同地区的人群中发病率不同，例如镰状细胞贫血(sickle cell anemia),非洲黑色人种发病率高，而囊性纤维化症(cystic fibrosis)常 见于美国白色人种，这二种遗传疾病在我国为罕见病例。中国较常见的遗传 疾病有地中海贫血、甲型血友病、乙型血友病、苯丙酮尿症、杜氏肌营养不 良症(DMD)、葡萄糖-6磷酸脱氢酶(G-6PD)缺乏症、唐氏综合
11、症(Downs syndrome)等。根据不同遗传疾病的分子基础，可采用不同的技术方法进行诊断，不但可对 有症状患者进行检测，而且对遗传疾病家族中未发病的成员乃至胎儿甚至胚 胎着床前(preimplantation)进行诊断是否携带有异常基因，这对婚育具 有指导意义。地中海贫血(地贫)是世界上最常见和发生率最高的一种单基因遗传疾病 (monogenic disease)，由于一种或几种珠蛋白合成障碍导致a类与p类 珠蛋白不平衡造成的，临床以贫血、黄疸、肝脾肿大及特殊外貌为特征，地 贫最常见的有两类：a地贫和p地贫。a地贫(a -thalassemias)的分子基础主要为a珠蛋白基因缺失，也有部
12、分 病例是由于碱基突变造成的。可采用限制性内切酶图谱方法检测a珠蛋白 基因的缺失。人a珠蛋白基因簇位于16号染色体，长度29 kb，包含7个连锁的a类基 因或假基因。a基因（a 1及a 2编码序列相同，仅非编码序列稍有差别， 产物相同），该基因簇上有2个EcoRI识别位点，经EcoRI酶解，进行Southern 印迹，用标记的a基因片段作探针，得到一条23 kb的杂交条带，BamHI识 别位点有4个，但只有14 kb片段能与mRNA基因探针杂交，见图21-5。HbBarts胎儿水肿综合征：由于该病患儿二条16号染色体的4个a珠蛋 白基因均缺失，不能合成a链，胎儿全身水肿、肝脾肿大、四肢短小，常
13、 于妊娠30-40周死亡或早产后半小时内死亡。样本DNA经限制性内切酶图 谱分析不能显示a珠蛋白基因区带，RNA诊断也测定不出有a珠蛋白基因 的 mRNA。缺失型HBH病：由于一条16号染色体上的两个a珠蛋白基因均缺失，另一 条16号染色体上则缺失一个a珠蛋白基因，并缺失3.7 kb长度的DNA片 段（右侧缺失型）或4.2 kb片段（左侧缺失型），DNA诊断只产生19 kb长 度的EcoRI片段，或10kb BamHI片段。标准型a地贫：一条16号染色体上2个a珠蛋白基因全部缺失。而另一 条16号染色体上具有2个正常的a珠蛋白基因，DNA诊断结果，EcoRI和 BamHI都出现与正常一样的23
14、 kb或14 kb的条带，但杂交条带的放射性自 显影较正常人浅。P地贫（。-thalassemias）的基因诊断：p地贫的分子基础不同于a地贫， P珠蛋白基因通常并不缺失，而是由于基因点突变或个别碱基的插入或缺 失。每一民族和人群P珠蛋白基因点突变部位不尽相同，都有特定的类型 谱。（二）感染性疾病过去对感染性疾病（infectious diseases）的诊断，一是直接分离检查病原 体，或者对患者血清学或生物化学的分析。有些病原体不容易分离，有些需 经过长期培养才能获得。血清学对病原体抗体的检测虽然很方便，但是病原 体感染人体后需要间隔一段时间后才出现抗体，并且血清学检查只能确定是 否接触过该
15、种病原体，但不能确定是否有现行感染，对潜伏病原体的检查有 困难。对感染性疾病的基因诊断具有快速、灵敏、特异等优点。80年代建立的PCR 技术已广泛应用于对病原体的检测。一般根据各病原体特异和保守的序列设 计引物，有的还合成ASO探针，对病原体的DNA可用PCR技术直接检查，而 对RNA病毒，则采用RT-PCR。现在市场已经有许多种病原体的测定药盒供应， 每一盒包含扩增某种病原体的特异引物，所需的酶以及配妥的各种反应试剂，并附有可行的操作方法步骤。病毒性感染：多种病毒性感染都可采用基因诊断检测相应的病原体，如甲型、乙型、丙型 和丁型肝炎病毒，人免疫缺陷病毒、可萨奇病毒、脊髓灰质类病毒、腺病毒、
16、EB病毒、疱疹病毒、人巨细胞病毒、乳头状病毒 等。最近新发现的SARS 冠状病毒，在基因组(RNA)序列确定后，便很快建立了 RT-PCR的基因诊断 法。细菌性感染：可应用基因诊断检测多种致病性的细菌，如结核分枝杆菌、痢疾性大肠杆菌、 霍乱弧菌、淋球菌、绿脓杆菌等。寄生虫：恶性疟原虫、克鲁斯锥虫、利什曼原虫、血吸虫、弓形虫等都有基因诊 断的方法其它:如衣原体、支原体、真菌性感染也均用基因诊断。(三) 恶性肿瘤分析一些原癌基因的点突变、插入突变、基因扩增、染色体易位和抑癌基因 的丢失或突变，可以了解恶性肿瘤的分子机制，有助于对恶性肿瘤的诊断， 对肿瘤治疗及预后有指导意义。(四) 法医学中的应用对生物个体识别和亲子鉴定传统的方法有血型、血清蛋白型、红细胞酶型和 白细胞膜抗原(HLA)等，但这些方法都存在着一些不确定的因素。近年来对 人基因结构的深入研究发现，有
