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1、人类胚胎干细胞基础技术高级培训班2010-12目录1. 绪论 2. 饲养层细胞的制备 2.1 从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（ MEF） 2.2 MEF勺传代2.3 MEF勺冻存2.4 MEF勺失活3. 饲养层细胞勺准备 4. ES/iPS细胞的复苏 5. ES/iPS 细胞勺传代 106. ES/iPS 细胞勺冻存 7. 人类胚胎干细胞勺无滋养层培养 7.1人类胚胎干细胞条件培养基（CM的收集 137.2 无饲养层人胚胎干细胞系勺培养及传代 8. 拟胚体的形成 9. 胚胎干细胞全能性的鉴定 9.1 碱性磷酸酶活性检测 9.2 干细胞表面 marker 的免疫染色检测 9.3 干性因子的去甲基化
2、程度分析 9.4 干细胞内源基因的表达分析 9.5 端粒酶活性检测 9.6 核型检测 9.7 拟胚体形成 9.8 畸胎瘤形成实验 10. 干细胞技术培训及服务一览表 11. 附录 1. 绪论本操作手册将为您详细介绍人胚胎干细胞 /iPS 细胞培养的基础知识、技术细节及相关的 产品信息。 目的是为了让您更好地培养您购买的细胞， 请按照此手册进行培养操作直至获 得可靠的冻存细胞。上海斯丹赛生物技术有限公司专业提供各类胚胎干细胞 /iPS 细胞及 成套产品服务，为您的干细胞研究提供一站式解决方案。2. 饲养层细胞的制备材料与仪器成纤维细胞完全培养基，货号EFM-01+ 胰酶，货号M-005-1 成纤
3、维细胞冻存液（2x），货号EFFM-01 基质胶（Matrigel matrix ），BD Pharmingen，货号 356235 CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF,货号MEF-CF1-01 T25透气培养瓶，NUNC货号156367 T75透气培养瓶，NUNC货号156499 2 ml移液管，NUNC货号159617+ 5ml移液管，NUNC货号159625+10 ml 移液管，NUNC 货号 159633+ 15ml离心管，货号366036+ 50ml离心管，货号373660+ 冻存管，NUNC货号377267+ Thermo-Fisher Finn pipette F3移液器和灭过菌
4、的枪头律生物安全柜，货号+ CO2培养箱，Thermo, HERA cell 150i+ 电子计数器，millipore ，货号PHCC00000+ 电动移液器，Thermo Scie ntific Finn pipette C1，货号 4580800+ 低速离心机，Thermo Scie ntific CL10+ 液氮罐，Thermofisher，货号 CN509002.1从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF1. 拉断颈椎处死怀孕12-13天的CF-1小鼠，浸入70%的酒精中消毒。2将小鼠放在超净台无菌的解剖盘中，在腹中线处做一横向切口。3. 剪开的皮肤拉向切口的上下两侧，提起腹膜，将其剪开
5、，充分暴露腹腔。4. 找出子宫，一只手用无菌钝口镊子轻轻提起子宫，另一只手持无菌镊子小心分离子宫周围的结缔组织。当两侧子宫都与其相连的组织分离好后，用剪刀将左右两侧的子宫在输 卵管与子宫角的衔接处剪下，小心剪下子宫的联体部分，置于无菌的60mn培养皿中。5. 用无菌的剪刀在子宫头与子宫尾分别剪去输卵管及子宫角部分。6. 将子宫置于15ml离心管中，用10mlPBS洗三遍。7. 用尖镊子撕开子宫壁和胎膜，取出胎鼠，放在新的培养皿中。8. 用8mlPBS将胎鼠洗三遍。9. 用灭菌的眼科剪刀去除胎鼠的胚囊，释放胚胎，并胚胎计数10. 将胚胎移到干净的培养皿中，PBS洗三次。11. 用镊子小心的去除胚
6、胎的头和肝脏，PBS洗三次。12. 将胚胎转移至新的培养皿中，用无菌剪刀将组织充分剪碎，加入0 . 25 胰酶同时吹打几分钟使其消化均一并彻底酶解。13. 用同样体积的MEF完全培养基中和胰酶。14. 一个T75瓶加10ml MEF完全培养基，按照每2-3个胚胎一个T75瓶，将已消化的胚 胎加入培养瓶中，放在5% CO2培养箱中培养，培养瓶注明细胞名称，代数及日期。2.2 MEF的传代1. 将T75瓶中的MEF培养基吸出。2. 加入大约3ml胰酶，于37C的CO2培养箱中放置3-5分钟3. 取出瓶子，轻轻晃动，可以看见白色的细胞层开始从瓶子的底壁掉落。确保瓶盖是拧 紧的。用手掌根轻拍瓶侧 3-
7、5 次。在灯下观察细胞是否已从瓶子上脱落。4. 加入同等体积（3ml）的MEF培养基，混匀，吹打几次以形成单细胞悬浮液。Note: 这一培养基是包含血清的，将会完全抑制胰酶的活性。5. 补加42mlMEF培养基到瓶子中，使总体积达到 50ml，混匀。6. 将上述细胞悬浮液均分至5个新的T75瓶子中，每瓶10ml。7. 放在5% CO2培养箱中培养，逐日观察。2.3 MEF的 冻存1. 吸去培养液，加3ml0.25 %胰酶至完全覆盖瓶底（以T75为例）。2. CO2 培养箱中孵育 3-5 分钟，不时轻拍瓶壁，使细胞层脱落。3. 加入同等体积的MEF培养液中和胰酶，吹打混匀。4. 将其转移至15m
8、l离心管，用电子计数器进行细胞计数后， 以1000rpm的速度离心5分 钟。5. 移去上清，用少量新鲜的 MEF培养液重悬细胞沉淀。6. 缓慢加入等量的MEF细胞冻存液（2x）并混匀。7. 分装上述细胞悬液于2ml冻存管中，每管0.25ml。8. 在冻存管上注明细胞名称，代数，数目，冻存时间。9. 将冻存管放到冻存盒中，-80 C冰箱过夜。10. 最后将冻存管转移至液氮罐中以便长期保存。2.4 MEF勺失活1. MEF传代到3-5代时，当细胞铺满培养瓶后（以 T75为例），力卩3ml 0.25 %胰酶，放 入37 T的CO2培养箱孵育3-5分钟。2. 加入同等体积的MEF培养液中和胰酶，用移液
9、枪吹打几次以形成单细胞悬浮液。3. 将所有细胞悬液混合到一个 50ml离心管中，补加适量新鲜的 MEF培养液。4. 取0.5ml上述细胞悬液，转移至新的15ml离心管中，用4.5ml培养液稀释，混匀。5. 用电子计数器计数细胞。6. 将原来的50ml离心管封口，使用gamaM线辐照仪，50-80戈雷辐照。7. 辐照完后，以1000rpm的速度离心5分钟。8. 移去上清，用适量新鲜的 MEF培养液重悬细胞。用于培养人胚胎干细胞的饲养层细胞标准浓度是30,000 cells/cm2。按照此标准铺板。具体铺板步骤请见 3饲养层细胞的准 备。对于暂时不用的细胞，将其冻存，需要时复苏。具体冻存步骤请见2
10、.3 MEF的冻存。3. 饲养层细胞的准备材料和仪器 CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF,货号MEF-CF1-01+ 成纤维细胞完全培养基，货号EFM-01 基质胶（Matrigel matrix ），BD Pharmingen，货号 356235+ CO培养箱，Thermo, HERA cell 240+ Thermo-Fisher Finn pipette F3移液器和灭过菌的枪头 T25透气培养瓶，NUNC货号156367 2 ml移液管，NUNC货号159617+ 5ml移液管，NUNC货号159625+10 ml 移液管，NUNC 货号 159633+ 电动移液器，Thermo Sc
11、ie ntific Finn pipette C1，货号 45808003.1加入足量的基质胶均匀铺到瓶（或孔板或皿）底部，以能覆盖全部底部为准，譬如T25 透气培养瓶以超过0.5ml为宜。3.2 37 C培养箱放置至少30min。3.3从培养箱中取出瓶（或孔板或皿），轻轻推送板子将未被基质胶覆盖的地方再次覆盖， 然后立即吸弃基质胶。3.4加入适量成纤维细胞完全培养基 （37C预孵育超过10min）,譬如T25透气培养瓶以加 入4ml为宜。3.5从液氮中取出冻存的失活过的 MEF细胞，立即投入37E水浴中，迅速解冻（1min之 内）。3.6根据预实验将相应数量的饲养层细胞加到之前已经准备好的瓶
12、（或孔板或皿）中，混 匀。推荐的饲养层细胞密度为 3万cells/cm2。Poi nt饲养层细胞需在ES/iPS细胞传代前两至三天准备。饲养层细胞的密度最适宜是80- 90%,太密或是太稀疏都容易使干细胞分化。请在铺被前先做预实验估算细胞的复苏存活率，以一个T25培养瓶计算，若存活率为90%则铺入的细胞量应为83.3万。 Note:饲养层细胞铺了 10天之后推荐不再使用 Table1培养容器的类型和需要的基质胶的体积培养容器的类型基质胶体积24-well0.1-0.2ml12-well0.2-0.4ml6-well/35mm0.4-0.5ml60mm/T25 Flask0.5-1ml100mm
13、/T75 Flask2-3mlTable2培养容器的面积和需要接种的 MEF细胞悬浮液的体积（接种细胞的浓度为1.5 x 105cells/ml )培养容器的类型细胞悬浮液的体积24-well0.4ml12-well0.8ml6-well/35mm2ml60mm/T25 Flask5ml100mm/T75 Flask15ml Note:上述细胞接种密度按人类ES/iPS细胞培养的标准计4. ES/iPS细胞的复苏材料和仪器 人类 ES/iPS 细胞(SiDSH -01, SiDSH -03 ),货号 HIPS-01/03律人类胚胎干细胞完全培货号 HESM-01-500+ CO培养箱，Ther
14、mo,货号 HERA Cell 240+ Thermo-Fisher Finn pipette F3移液器和灭过菌的枪头+ 电动移液器，Thermo Scie ntific Finn pipette C1，货号 4580800 T25透气培养皿，NUNC货号156367+ 5ml移液管，NUNC货号159625+ 15ml 离心管，NUNC 货号 3660364.1解冻人ES/iPS细胞，从液氮中取出冰冻的人类 ES/iPS细胞冻存管，立即投入 37C水浴中快速的旋转以迅速解冻(控制在1min之内)。 Note:水不要淹没瓶盖4.2当只有一片冰晶存在时，从水中取出冻存管。用消毒酒精棉将冻存管外
15、壁擦拭一遍，以去除水缸中的微生物。4.3将细胞转移到一个预装有 2ml人类胚胎干细胞完全培养基的 15ml离心管中，混匀。200xg (1000rpm),离心 5 分钟。4.4吸弃上清液。用4ml的人类胚胎干细胞完全培养基重悬细胞沉淀。4.5转移悬浮液到一个预铺有饲养层细胞的 T25瓶中，补加人类胚胎干细胞完全培养基至总体积为5ml。4.6将瓶放入37 T的CO2培养箱中，观察细胞每天的生长情况。Poi nt复苏的第二天无需更换培养液，从第三天起每天更换新鲜的人类胚胎干细胞完全培养基。复苏后第5天左右可以看见微小的克隆出现，之后逐渐长大。复苏后第10-12天传代，具体情况视ES细胞生长情况而定。5. ES/iPS细胞的传代材料和仪器人类胚胎干细胞培养液（含 bFGF货号HESM-01-500 ;不含bFGF货号 HESM-O2-5O0+ W
