胰蛋白酶分离工艺

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1、1、集落刺激因子（G-CSF）组成结构：是一种含有二硫键的单链糖蛋白，由175个氨基酸残基组成的单链非 糖基化多肽链理化性质：性状：无色澄明液体 分子量：20000，等电点为5.86.6 溶解度： 稳定性：生理作用与临床适应症：作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是 刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及 噬酸性细胞的多种功能，主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞 减少症，分离纯化工艺：G-CSF为无菌冻干粉剂，由含有10mM醋酸钠pH为4的蛋白溶液经0.2um过滤后 分装冻干。由含有高效表达人G-CSF的原核表达系统（E.coli）经发酵、

2、分离和高度纯化后 经冻干制成。正常成人尿液超滤浓缩滤液透析透析液至入饱和度沉淀缓冲液溶解透析透析液DEAE -纤维素柱层析洗脱液盐析沉淀蛋白质沉淀缓冲液溶解透析透析液柱层析洗脱液聚乙二醇浓缩纯化液SephadexG 1502、超氧化物歧化酶（SOD）：组成结构：理化性质：性状：淡蓝色冻干粉结晶体 分子量：32000左右 溶解度： 稳定性：耐热性强，90C环境120分钟酶活几乎没有损失，100C环境60分 钟酶活保持90%以上；稳定性高，在pH4.011.0范围内酶活稳定。生理作用与临床适应症：是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过 氧化氢的酶，是一种重要的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的

3、细胞分离纯化工艺：血液预处理,洗涤红细胞和溶血;去除大部分杂蛋白得SOD粗品;再经柱层析分离 得到精品。猪血经血液预处理、洗涤红细胞、溶血、乙醇一氯仿混合液除去血红 蛋白，然后用坟柳043HZO萃取、丙酮沉淀、55 65C热变性得到粗酶液。粗酶 液上阴离子DEAE 一 Cellulose52交换层析柱、分子筛SephadexG-75柱,最终获 得了纯化的铜锌超氧化物歧化酶。离心新鲜猪血2组%匀浆钾匀浆液去心浆红细胞便离清洗沉淀细胞溶胀溶血液 加入预冷过的乙醇，氯仿上清液加入K 2 HPO 4萃取上层液离心上清液加入预冷过的丙酮沉淀重蒸水溶解粗提液 透析离心几淀55 - 65C热处理15mi n

4、,后冰浴粗提液磷酸钾缓冲液透析液离心上清液柱层析 洗脱液凝胶层析纯化液DEAE - Cellulose52 柱SphadexG - 75冻干冻干粉末3、胰蛋白酶：组成结构：理化性质：性状：白色或米黄色结晶性粉末 分子量：24000左右pI10.5 溶解度：溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚 稳定性：最适pH值7.88.5左右pH9.0不可逆失活生理作用与临床适应症：本品为蛋白质水解酶，能选择地水解蛋白质中由赖氨酸 或精氨酸的羧基所构成的肽链，能消化溶解变性蛋质，对未变性的蛋白质无作用， 因此，能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促 进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用

5、。临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、痿管等所产生的局 部水肿、血肿及脓肿等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒蛇咬伤。 还常用于动物细胞培养前对组织的处理。分离纯化工艺：鸡卵类粘蛋白是一种专一性很强的胰蛋白酶的抑制剂，对猪和牛的胰蛋白酶有很 强的抑制作用（而对胰凝乳蛋白酶无抑制作用）。在PH7.68.0的范围内，猪 或牛胰蛋白酶能牢固地吸附在鸡卵类粘蛋白上，在pH2.53.0的范围内，能从 鸡卵类粘蛋白上被洗脱下来。因此，采用鸡卵类粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂， 可以从胰蛋白酶粗品直接获得高纯度的胰蛋白酶。反应的基本原理如下：OH載体活化咖|偶联一 CHj + OZ环预氧

6、丙烷NH土-鸦卵黏蛋白配基乡一qCH；CH CHjn-NH一期丽站凿白+胰蛊P1論 纟OH亲和吸附剂混合样品|-OH|亲和结台OH亲和结合51合物|洗脱-O-CH2-CH -CHj-NH-SP黏蛋白*闕蛋白隔OH_QH亲和唾附剂| -0 CHjCH 一 CHjNH-鸿卵黏螢自一胰蛋宣誨纯化样品OH醍鱼粗酶液 离子父换层析 洗脱液透析透析液 浓缩 浓缩液凝胶层析Q - SepharoseFF聚乙一醇Sephacryl 一 300洗脱液 离子交换层析 洗脱液透析透析液浓缩纯化液Q - SepharoseFF脱盐4、蚓激酶：组成结构：理化性质：性状：微黄色粉末 分子量： 溶解度： 稳定性：在碱性环境

7、中则相对稳定生理作用与临床适应症：是一种多分子重组口服制剂，与血栓（纤维蛋白）有特 殊的亲和力，能够跟踪溶栓，有效溶解微栓，改善微循环，加强心、脑血管侧支 循环，开放性修复血管受损内皮细胞，增加血管弹性，改善血管供氧功能，降低 血液粘度，降低血小板聚集率，抑制血栓再次形成。修复血栓发生后周边坏死脑 细胞，挽救半暗区。目前已广泛用于临床，并越来越多地用在心、脑血管、内分 泌，呼吸系统等疾病的预防和治疗中心。分离纯化工艺：（一）鲜蚓清洗 在筐中或地面上将蚯蚓上部泥土层层除去，把蚯蚓铺成薄 层，光照1018小时，让蚯蚓排出污物，用自来水在槽中冲洗二遍，洗去泥和 粘浮物，用塑料桶装盛，贮存于冷库中备用

8、； （二）磨浆 用胶体磨将蚯蚓磨成浆液，蚯蚓与按（V/V） 1 : 35的比例加入低浓度乙醇的pH5. 05. 3 的柠檬酸钠制成匀浆；（三）除渣用沉降离心机将料液中的粗渣去除，制得上清液；（四）盐析上清液中按30%饱和浓度加入硫酸铵，搅拌完全溶解后静置1小时；（五）离心用立式高速离心机经高速离心将料液中细渣去除，制得清液；（六）超滤 取上清液用50, 000dt膜超滤，得超滤液；（七）柱层析分离将超滤液用泵送到下料桶，混合上样，上样完毕，用洗涤液，洗至流出液呈淡黄色，pH7. 08. 0,略呈碱性，再用洗脱 液洗脱，洗脱液变混浊，颜色由黄变红，流出液电导率比洗脱液电导率略高时开 始收集，洗脱

9、至料液变清，颜色呈淡橙色，电导率达到洗脱液电导率（不小于 9000m s/cm）为止；（八）超滤将收集液倒入贮罐内，开泵，调转速21X12rpm，调节压力不大于0. 1Mpa，浓缩至1/15，收集料液澄清，澄清完再 上柱加去离子水脱盐，至浓缩液呈中性（pH=7. 0）最后浓缩至1/（1620）；（九）过滤、除菌用澄清型、除菌型液净滤板过滤3遍，至滤液澄清，在30万级用0. 22um微孔滤膜进行灭菌过滤；（十）喷干在干燥塔中，使出口温度控制在8086C干燥料液，收集酶粉。新鲜蚯蚓预处理洗净光照，让蚯蚓排出污物洗净蚯蚓捣碎碎片乙醇溶解匀浆离心去除粗渣上清液十盐析岸、盐析液 离心上清液超滤液柱层析洗

10、脱液加硫酸铵去除细渣50,00dt膜超滤共分离滤液灭菌过遽滤液喷干酶粉超滤脱盐新鲜蚯蚓预处理洗净光照，让蚯蚓排出污物洗净蚯蚓捣碎碎片匀浆匀浆液离心4C上清液超脱盐D滤液浓缩粗酶液离心上清液ye：凝胶层析7洗脱液离子交换层析洗脱液 疏水色谱层析纯化液5、细胞色素C：组成结构：其肽链仅有104个氨基酸，其中赖氨酸含量较高，故为碱性蛋白。 理化性质：性状：红色冻干粉 分子量：11000-13000 溶解度：易溶于水，在酸性溶液中溶解度更大 等电点10.2-10.8，含铁量0.37-0.43%细胞色素C对热，酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起部分 失活。生理作用与临床适应症：细胞色素C

11、与细胞凋亡有关，从线粒体中泄露出的细胞 色素C有诱导细胞凋亡的作用。本品用于组织缺氧的急救和辅助用药，如一氧化 碳中毒、催眠药中毒、新生儿窒息、严重休克缺氧、麻醉及肺部疾病引起的呼吸 困难、高山缺氧、脑缺氧、心脏疾病引起的缺氧等。分离纯化工艺：牛心脏预处理牛心肉末提取提取液中和滤液人造沸石吸附吸附细胞色素C沸石 氨水洗脱洗脱液士中盐匸心、盐析滤液CTA沉淀厶红色细胞色素C沉淀25%（ NH 4）2SO 4加固体硫酸铵20%二氯乙酸透析细胞色素C粗品 离子交换层析 吸附细胞色素C树脂除去硫酸根离子弱酸性阳离子父换色谱洗脱洗脱液叭送析 p精品细胞色素CNaCl- Na2 HPO 4除去氯离子6、肝

12、素钠：组成结构：粘多糖硫酸酯类抗凝血药 理化性质：性状：白色或灰棕色无定性粉末，无臭，无味，有吸湿性 分子量：12000 溶解度：易溶于水，不溶于乙醇，乙醚,丙酮和苯等有机溶剂 稳定性：生理作用与临床适应症：治疗各种疾病并发的播散性血管内凝血早期。2预防动、静脉血栓和肺栓塞。3治疗动、静脉血栓和肺栓塞，缺血性脑卒中，不稳定型心绞痛（减轻症状、 预防心肌梗塞），急性心肌梗塞（防止早期再梗塞和梗塞区延展，降低病死率）。4.人工心肺、腹膜透析或血液透析时作为抗凝血药物。5作为溶血栓疗法的维持治疗。6.用于输血时预防血液凝固及血库保存鲜血 等体外抗凝剂分离纯化工艺：一、原料处理：将新鲜的猪肠（或冷冻猪

13、肠自然解冻之后）用清水仔细清洗去除内外污物和 外部皮肤脂肪后，绞碎成糜状，并在充分搅拌下，加入等量的水混合后，再加入 少许溶度为0.1%的防腐剂混合均匀。二、酶解提取：先将上述原料在充分搅拌下，用少量稀碱液精细地调节至PH值为8-9 （可用 相应的精密PH试纸进行测定，下同）再加入事先已经绞碎的新鲜胰浆作为酶解 剂（所加入的猪胰浆按照原料液实际重量的1%-1.5%为宜），搅匀后，缓慢升温 至40度左右，继续搅拌，并保持料液PH=7.5-8，保持液温于37-40度下，酶解 3-4小时，然后升温至47-50度，维持PH值=8.0-8.5，再酌情补加少许猪胰浆 后，继续酶解4-5小时，在上述酶解过程

14、中，如果酶解料液的PH纸复查有所下 降之际，就应该及时用少许稀碱液（5%-8%NaOH溶液）仔细调整。盐酸调整其 PH=5.5-6,然后升温至80度。在充分搅拌下，加入料液总重量5%左右的精盐（含 NaCL95%，钙镁钙盐0.5%），使之混溶均匀后，再升温90度，保温30分钟， 停止搅拌，趁热过滤除去杂质，待滤液冷却至37度时，用稀碱液调整其PH=10.5, 精细过滤，滤液回调其PH=9.0-9.5范围内进行离子交换吸附处理。三、离子交换吸附；先将上述酶解提取液冷却至室温，仔细捞除浮于液面的油脂薄片层，控制升 温至45度，停止加热，在搅拌下加入事先预处理好的D-254型树脂已有效的吸 附料液中

15、的肝素钠成分，新树脂的用量一般为料液的2.55-3%,用过后的再生树 脂应酌情加大其用量，搅拌、吸附处理3个小时后静置过滤，滤液可作为生产治 疗冠心病的新药冠心舒的原料。将上述已经吸附有肝素成分的D-254树脂先用清水充分漂洗，干净后，再用 大约一倍的1.2mol/L氯化钠溶液对洗涤好的D-254树脂进行肝素钠操作：第一 次洗脱液为树脂体积的1.5倍左右，大约洗脱4小时，第二次洗脱为树脂体积的 0.5倍左右，洗脱时间为1小时。滤干树脂，将洗脱液予以合并。将上述所得 的洗脱液调节到PH=10-11,搅拌30分钟后，静置6小时，然后仔细的析出上层 清液，下部沉淀物尽量的抽滤至干。合并清液和滤液，精细调节PH=6.0-6.5, 加入1.5倍量的95%乙醇沉淀过夜，翌日，仔细地烘吸出上层清液，收集下部沉 淀物，抽滤至干（母液可套用于调PH值前的洗脱液中）。经真空烘干，即得肝 素钠粗品。