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1、荧光定量PCR在肺结核临床诊断及疗效评估中的应用 建立荧光定量PCR检测结核分枝杆菌方法，评估其在肺结核的临床诊断和疗效评估中的应 用价值。方法 针对结核分枝杆菌保守序列IS6110基因设计引物和探针，建立荧光定量PCR 方法。分别以荧光定量PCR、集菌培养和染色镜检法检测疑似肺结核和确诊肺结核患者随 访的痰标本，比较各方法在结核病诊断以及治疗效果评估中的作用。结果荧光定量PCR的 检测灵敏度为4 Copies/反应，远高于抗酸染色法和集菌培养法。荧光定量PCR法与集菌培 养法和抗酸染色法对临床样本的检出率分别为64.29%、35.12%和12.5%。患者治疗效果的 随访检测结果显示，结核分枝
2、杆菌的数量呈持续减少的趋势。结论荧光定量PCR方法具有 快速、敏感和特异性高的特点，可以快速、及时获取肺结核患者服药后的治疗效果，为医生 的后续督导治疗提供依据，具有重要的临床意义。结核病是全球性的重大公共卫生问题之一。全球现有肺结核病人2000多万，其中95%在发 展中国家1，我国是22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核患者居世界第2位，每年 因结核病死亡的人数达到15万人，给国家和社会带来沉重负担，严重影响我国经济和社会 的发展。结核分枝杆菌的实验室检测是结核病诊断和治疗转归确认的重要依据。提高实验室检测能 力，促进早诊断、早治疗是有效控制结核病蔓延的必要措施。目前临床以集菌培养和染色镜
3、 检法为主要的实验室检测手段。大量研究表明，传统方法的检出率低、培养周期长，已难以 满足临床需要3, 4。荧光定量PCR是近年发展起来的一种重要的基因诊断技术，具有灵 敏度高、特异性好、可定量、污染少、易于标准化等优点。该研究建立了荧光定量PCR检 测临床结核分枝杆菌的方法，并对荧光定量PCR在临床肺结核诊断和疗效评估中的应用进 行了评价，现将结果报告如下。1材料与方法1.1 标本1.1.1疑似肺结核病患者 采集2009-2010年5月某传染病院诊断的疑似肺结核患者痰液标 本168份，其中男性115份，女性53份，年龄1560岁。疑似肺结核病患者的确认依据结 核病诊断指南，患者出现咳嗽、咳痰3
4、周或以上，可伴有咯血、胸痛、呼吸困难，或者发热， 盗汗、乏力、食欲降低、体重减轻、月经失调等症状，临床需进一步做痰和胸部X线检查的 患者51.1.2确诊患者选择临床确诊肺结核病患者。为确保样本采集的连贯性，在争取患者同意 随访的同时，选择暂时在家休养的就近患者，共选取5例活动性肺结核患者。样本采集患者 漱口后痰液，在服药前1d即开始留样，服药后，在随访中17d内每天采集1次，后续间 隔25d采集1次。1.2仪器 Bact/Alert 3D全自动细菌快速培养和药敏检测系统、Heraeus低温冷冻离心机 Megafuge 1.0R、Biospec-mini DNA/RNA/Protein anal
5、yzer (岛津)、7500 荧光定量 PCR 扩增 仪(Applied Biosystems)、凝胶成像系统(英国 UVI tec)。1.3抗酸染色法与集菌培养法 操作参考结核病诊断细菌学检验规程5进行。1.4痰液DNA的提取 取0.5ml痰标本加入2倍样本体积4%的NaOH，液化10min后15 000r/min离心5min，去上清液；向沉淀中加入0.5ml灭菌水，充分振荡混匀，15 000r/min 离心2min，去上清，重复洗涤3次；沉淀中加入50gl DNA提取液(1%NP-40 + 2 % Triton X-100)，充分振荡混匀，100C水浴10min；待冷却至室温，15 000
6、r/min离心5min，取上清 液备用。1.5荧光定量PCR方法1.5.1引物与探针设计 针对IS6110基因设计引物与探针，上游引物：5 -GTCGCCCGT CTACTT AAT G-3 ，下游引物：5 -GCG GAT TCT TCG GTC GTG-3 ，产物长度为 107bp。 探针：5 FAM-CCG ACG GTG CGT AAG TGG GTG CGT CGG-DABCYL3，由上海基康生 物技术有限公司合成。1.5.2 反应条件 反应体系(40pl)： 4.0 10 X buffer，7.0mmol/L Mg2+，200pmol/L dNTP， 0.2pmol/L上下游引物，
7、0.2pmol/L探针，4pLDNA模板，2.5U Taq DNA聚合酶。扩增条件： 94C 3min； 94C 20s，52C 20s，72C 20s，40次循环。试验设定阳性对照、弱阳性对照 与空白对照(no template control, NTC )。按照荧光定量PCR分析软件设定基线(baseline) 与阈值(threshold)，以标准品浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。1.5.3标准品制备 以结核分枝杆菌H37Ra为参考菌株，PCR扩增IS6110基因并克隆到质 粒载体。提取 纯化重组DNA，10倍梯度稀释 至107Copies/mL作为强阳性标准品， 10
8、3Copies/mL作为弱阳性标准品。1.5.4特异性以结核分枝杆菌H37Ra为阳性标本，提取牛型分枝杆菌、偶发分枝杆菌、蟾 分枝杆菌、草分枝杆菌、龟分枝杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎 奈瑟氏菌为模板检测引物与探针的特异性。1.5.5灵敏度与标准曲线绘制 抽提标准品DNA，10倍系列准确定量稀释102107Copies/mL 的DNA模板，分别取4gL进行荧光定量PCR扩增，。1.5.6结果判定 荧光定量PCR扩增曲线规则，呈对数增长，Ct值36即可判定为阳性； 如扩增曲线不规则或Ct值40，报告为阴性；如Ct值在3640之间，且扩增曲线呈对数 增长，样本重复测定，如Ct
9、值仍在3640之间报告为阴性。2 结果2.1荧光定量PCR法的特异性 结核分枝杆菌H37Ra出现特异扩增，凝胶电泳出现107 bp 条带。对该PCR产物进行测序，序列分析显示为结核分枝杆菌核酸序列，其他非结核分枝 杆菌扩增结果均为阴性。2. 2荧光定量PCR法的灵敏度与线性 以10倍梯度稀释配制原始拷贝数102107Copies/mL 的标准品系列，取4ML进行分子信标 荧光定量PCR，绘制标准曲线，其回归方程为 Ct=-3.61344 logC0 + 45.78456，线性范围为 4X 102107Copies/mL，r=0.99503, Ct 值与 DNA 模板含量呈线性关系。经多次重复试
10、验，最低可检测4 Copies/反应，见图1。图1荧光定量PCR法检测结核分枝杆菌标准曲线2.3肺结核的诊断 采集168份疑似结核病患者痰标本，集菌培养法和涂片染色法阳性检出 率分别为 35.12%(59/168)、12.5%(21/168)，荧光定量 PCR 法阳性检出率 64.29%(108/168)。 对抗酸染色法和培养法阳性的样本，荧光定量PCR法的灵敏度分别为100%和95.4%。对 20份正常人群来源的痰标本，荧光定量PCR方法检测结果为阴性，符合率为100%。2.4随访检测 随访周期3个月，对5例活动性肺结核进行了动态检测。荧光定量PCR检 测结果显示，随着临床治疗方案的进行，病
11、人晨痰中结核分枝杆菌的数量呈持续下降的趋势(即Ct值增加)。随访期间连续4次测定患者标本的结果，Ct值分别为26.60、27.58、28.25、 29.14，呈连续增加(图2)。为保证检测结果的准确性，每份晨痰都进行平行测定。图2随访期间荧光定量PCR连续测定肺结核患者标本扩增曲线随访期间，3例患者转阴，2例仍为阳性。病例1为男性，23岁，发病时间约2个月，病程 较短，病情较轻，治疗前X线检查未见异常，痰涂片检查：涂阳1+，服药后在1个月内迅 速转阴，结核分枝杆菌从105copys/mL减少到不能检出。病例2、3、4、5治疗前X线检查 均有不同程度的异常，病程较长，患病时间在半年以上。如病例2
12、为男性，41岁，X线检 查右上肺可见斑片状、条索状模糊影，密度不均，边缘不清，其中间见一空洞，无粟粒。痰 涂片检查结果为涂阳3+,诊断为III型涂阳肺结核患者。经过3个月的治疗，4例患者咳嗽、 咳痰等临床症状均有减轻。病例2和3涂片与荧光定量PCR检测结果均转阴性，病例4、5 仍为阳性。随访各病例结核分枝杆菌Ct值随时间的变化曲线见图3。图3荧光定量PCR检测结核分枝杆菌CT值与随治疗时间变化曲线3讨论荧光定量PCR是近年发展迅速的基因诊断技术。与传统检测方法比较，荧光定量PCR的阳 性检出率有显著提高，研究中荧光定量PCR与传统的培养法和涂片法的阳性检出率分别是 64.29%、35.12%、
13、12.5%，与文献报道一致6，7。而且荧光定量PCR法极大地缩短了检 测的时间，有助于对患者确诊并及时采取治疗手段8, 9。目前临床所用实验室检测方法十 分落后，已成为阻碍我国结核病防治工作顺利展开的重要原因，在基层建立和推广特异性强、 灵敏度高的检测方法非常必要。在对5名确诊结核病患者的随访中发现，经过3个月的治疗，3名患者痰液中不再有结核分 枝杆菌检出。另2名由于感染时间较长，并有较大程度的器质性改变，经过治疗虽未很快转 阴，但排出的结核分枝杆菌数量也有显著减少。在随访监测期间，荧光定量PCR检测结核 分枝杆菌的Ct值随着治疗的持续进行呈不断增加的趋势（即细菌数量减少），且患者的临床 症状均有所缓解。为确保随访的持续有效，该次符合的病例较少，对结核病治疗效果评价的 规律还有待更多研究。但是，该研究采用荧光定量PCR方法监测结核分枝杆菌变化情况， 观察抗结核药物的治疗进展，并将治疗信息反馈给临床督导医生的方式，为临床医生及时掌 握病人的病情和开展后续督导治疗提供了动态的数据，在实践中起到了积极地作用，效果明 显，有重要的临床意义。
