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1、M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒目录号:DN21目录编号包装单位DN210150次DN2102100次DN2103200次 适用范围:适用于快速提取M13噬粒单链DNA 试剂盒组成、储存、:稳定性:试剂盒组成保存50次100次200次结合液 MB室温25 ml50 ml100 ml漂洗液 WB室温15 ml25ml2x25 ml第一次使用前按说明加指定量乙醇洗脱缓冲液 EB室温10 ml20 ml40 ml吸附柱AC室温50个100个200 个收集管(2ml)室温50个100个200个本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。储存事项:1. 结合液MB低温时可能出现析出和沉淀,可
2、以在37C水浴几分钟帮助重新溶解,恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。2. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。 产品介绍:M13 和其它的丝状噬菌体载体,在文库构建和为序列测序提供单链 DNA 和引人 突变方面十分有用。将适量M13丝状噬菌体或者相关噬粒(M13来源)感染的液体培 养物离心,上清中的单链噬菌体DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质 膜,再通过一系列快速的漂洗离心的步骤,将盐、细胞代谢物,蛋白等杂质去除, 最后低盐的洗脱缓冲液将纯净噬菌体单链DNA从硅基质膜上洗脱。 产品特点:1. 不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉
3、淀等步骤。2. 节省时间,简捷,单个样品操作一般可在10分钟内完成。3. 产量高,典型的产量800卩1 M13丝状噬菌体上清可以提取3|ig噬菌体单链DNAo4. 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.71.9。可以直接用来测 序,一般典型可辨认读长达 650bpo 注意事项1. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机, 如Eppendorf 5415C或者类似离心机。2. 开始实验前将需要的水浴先预热到50C备用。3. 结合液 MB 含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣 服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水
4、或者生理盐水冲洗。 操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)以800“噬菌体感染细菌培养上清提取举例:提示:第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入 后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!1. 将M13丝状噬菌体或者相关噬粒(M13来源)感染的液体培养物分装在1.5毫升 离心管,12,000rpm离心5分钟沉淀菌体。2. 小心取800皿上清转入新的1.5ml离心管,加入400皿结合液MB,充分混匀。如果使用的上清大于或者小于8O0gl,则结合液MB的用量需要按照比例增加或者 减少。3. 将上述混合物加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心
5、15 秒,倒掉收集管中的废液。吸附柱一次最多只可以容纳大约700但混合物,因此需要分次把混合物加到吸附柱 内,重复步骤3。4. 加入600皿漂洗液WB (请先检査是否已加入无水乙醇!),12,000rpm离心30 秒, 弃废液。5. 将吸附柱AC放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免 漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。6. 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加60皿洗脱缓 冲液EB (洗脱缓冲液事先在50C水浴中预热),室温放置1分钟,12,000rpm离 心1分钟。如果想得到较多量的DNA,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中, 10,000rp
6、m 离心 1 分钟。洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积, 但是最小体积不应少于40回,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。7. DNA可以存放在2-8C,如果要长时间存放,可以放置在一20C。附录(M13噬菌体感染细菌培养上清准备过程):下面举例说明 M13 噬菌体感染细菌培养上清准备过程,详细的 M13 噬菌体(或M13来源噬粒)培养和上清准备过程请参见分子克隆第二版。1. 37C振摇过夜培养合适的噬菌体宿主菌(如JM109)。2. 使用6%的过夜培养菌接种新鲜的LB培养液,37C振摇培养一个小时。3. 根据M13噬菌体的储存液的浓度(滴度)按照
7、0.5-1.5%(V/V)的比例加入噬菌体 来感染宿主菌。37C振摇培养5-6个小时。4. 将上面M13丝状噬菌体或者相关噬粒(M13来源)感染的液体培养物分装在1.5 毫升离心管,12,000rpm离心5分钟沉淀菌体。5. 可选步骤:小心取1毫升上清转入新的1.5ml离心管,重复步骤4离心5分钟。这步有助于去除上清中残留的微量宿主菌RNA或者DNA。6. 小心取800m上清转入新的1.5ml离心管。7. 现在可以按照操作步骤提取噬菌体单链DNA 了。问题与解决方法:问题评论与建议*试剂盒储存在非最佳条件 -建议:收到试剂盒后总是存放在室温 (15C-20C)*缓冲液或者试剂暴露于减少它们有效
8、性的条件下-建议:储存在室温(15C-20C),每次用完后立刻盖紧盖子,以免溶液蒸发,pH 改变和污染。低核酸产量 或者纯度不高*漂洗液 WB 中忘记加无水乙醇-建议:第一次实验时,在漂洗液WB 中加入指定量无水乙醇。*试剂和样品没有充分混匀-建议:加入每个试剂后都要充分混匀 *噬菌体上清滴度太低-建议:离心取噬菌体感染细菌培养物上清时离心最好不要超过5分钟,转速不要超过12,000rpm,否则噬菌体上清也可能离心下来。重新培养一次噬菌体感染细菌*洗脱效率不高-建议:确保做了步骤 5,否则残留乙醇会影响洗脱效率,仔细阅读步骤6和只使用洗脫缓冲液EB洗脫DNA 下游酶切*忘记做步骤 5,乙醇抑制了酶切反应-建议:做步骤 5,然后空气 中晾几分钟,让残留乙醇挥发。不能切开或者酶切不完全*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,抑制了酶切反应-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用纯化的 DNA产物 D260数值异常偏高*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,干扰了分光光度计读数-建议:将洗脫的回收DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使 用。