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1、乳酸菌的的分离与与发酵实实验生命科学学学院220099级四班班2组傅盛晟摘要：本本文对乳乳酸菌的的分离与与发酵实实验进行行阐述，从从市售酸酸乳中分分离保加加利亚乳乳杆菌和和嗜热链链球菌，并并进行分分离与鉴鉴定，最最后进行行酸乳的的发酵实实验！实实验主要要是分离离与纯化化，鉴定定与发酵酵，最后后用分离离的菌进进行酸乳乳发酵在在与市售售酸乳混混合菌种种进行比比较。关键词：酸奶，乳乳酸菌，分分离鉴定定，发酵酵微生物在在厌氧条条件下，分分解己糖糖产生乳乳酸的作作用，称称为乳酸酸发酵。能够引引起乳酸酸发酵的的微生物物种类很很多，其其中主要要能利用用可发酵酵糖生产产乳酸的的细菌，即即乳酸细细菌。常常见的乳
2、乳酸细菌菌属于链链球菌属属（Sttrepptoccocccus)、乳杆杆菌属(Lacctobbaciilluus)、双歧歧杆菌属属(Biffidoobatteriium)和明串串珠菌属属(Leuuconnosttoc)等。乳乳酸细菌菌多是耐耐氧菌，只只在厌氧氧条件下下才进行行乳酸发发酵，所所以在筛筛选乳酸酸茵或需需要进行行乳酸发发酵的情情况下，应应保证提提供厌氧氧条件。酸奶是以以全脂牛牛奶等为为原料，经经乳酸细细菌发醇醇而成的的一种具具有较高高营养价价值和特特殊风味味的发醇醇制品，是是具有一一定保健健作用的的食品。酸奶发发酵过程程通常是是由双菌菌或多菌菌的混合合培养实实现的。其中的的杆菌先先分
3、解酪酪蛋白为为氨基酸酸和小肽肽由此此促进了了球菌的的生长，而而球菌产产生的甲甲酸又刺刺激了杆杆菌产生生大量乳乳酸和部部分乙醛醛，此外外球菌还还产生了了双乙酰酰这类风风味物质质，因此，达达到了稳稳定状态态的彻合合发酵。酸乳发发酵的基基本原理理是通过过乳酸细细菌发酵酵牛奶中中的乳糖糖产生乳乳酸，乳乳酸使牛牛奶中的的酪蛋白白(在全乳乳中的质质量分数数为29，在在乳蛋白白中的质质量分数数为85)变性凝凝固而使使整个奶奶液呈凝凝乳状态态。同时时，通过过发酵还还可以形形成酸奶奶特有的的风味和和香味(与形成成乙醛、丁二酮酮等有关关)。酸奶奶发酵中中的主要要生物化化学变化化是：乳乳酸菌将将牛奶中中的乳糖糖发酵
4、成成乳酸使使其PH降至酪酪蛋白等等电点(4.6)附近(4.044.6)从而使使牛奶形形成凝胶胶状；其其次，乳乳酸菌还还会促使使部分酷酷蛋内降降解、形形成乳酸酸钙和产产生一些些脂肪、乙醛、双乙酰酰和丁二二酮等风风味物质质。这就是是酸奶具具有良好好的保健健作用和和适合广广大乳糖糖不耐症症患者饮饮用的主主要原因因。按凝凝固状态态可将酸酸奶分为为搅拌型型酸奶和和凝固型型酸奶，两两者工艺艺过程基基本相似似，本实实验主要要是凝固固型酸奶奶的制作作方法。一， 材料与方方法1. 材料和用用具1） 菌种，嗜嗜热乳酸酸链球菌菌，保加加利亚乳乳酸杆菌菌，这两两类菌种种可从市市场销售售的各种种新鲜酸酸乳或酸酸乳饮料料
5、中分离离。2） 培养基参参照相关关文献和和老师的的建议以以及乳酸酸菌生长长需要复复杂营养养物质和和多种生生长因子子，我们们选用如如下培养养基：分离纯化化培养基基：脱脂乳乳平板培培养基鉴定培养养基：脱脱脂乳试试管其他：脱脱脂乳粉粉或脱脂脂牛奶，蔗蔗糖等3） 仪器及用用具恒温培培养箱，高压蒸汽汽灭菌锅锅，超净净工作台台，培养养皿，试试管，三三角瓶若若干2. 培养条件件培养温度度：40厌氧条件件：由于于乳酸菌菌的发酵酵与分离离纯化都都需要厌厌氧条件件，而实实验室没没有专门门的厌氧氧培养箱箱，所以以我们采采用在培培养皿和和发酵杯杯上套上上保鲜膜膜制造无无氧环境境。培养时间间：在培培养基上上分离培培养的
6、时时间为2天左右右，酸乳乳发酵为为12个小时时左右方法和步步骤1）乳酸酸菌的分分离纯化化 (11)分离。取市售售新鲜酸酸乳或泡泡菜的酸酸液稀释释，取其其中的、2个稀释释度的稀稀释液各各0.110.2mLL，分别别接入脱脱脂乳琼琼脂培养养基上，用用无菌玻玻璃刮铲铲依次涂涂布，或或者直接接用接种种环沾取取原液，平平板划线线分离，置40下培养48h，如出现圆形稍扁平的淡黄色菌落及其周围培养基变为黄色者，可初步定为乳酸菌。 (22)鉴别。选取乳乳酸菌典典型菌落落转至脱脱脂乳试试管中，40培养8224h。若牛牛乳出现现凝固，无无气泡，呈呈酸性，涂涂片镜检检细胞呈呈杆状或或链球状状(两种形形状的菌菌种均分
7、分别选入入)，革兰兰氏染色色阳性，则则可将其其接种到到试管斜斜面上连连续传代代46次，最终选选择出在在366h能凝固固的牛乳乳管，作作菌种待待用。2）乳酸酸菌饮料料酸乳的的发酵 (1)将全脂脂乳粉和和水按质质量比为为1：(710)混匀，或或将新鲜鲜牛奶灭灭菌后，加加入质量量分数为为5、6的蔗蔗糖，充充分混合合，于880885灭菌1015mmin，然后后冷却至至3540，备用用。 (2)将分离离到的嗜嗜热乳链链球菌、保加利利亚乳杆杆菌及两两种菌的的等量混混合菌用用接种环环蘸去加加入调配配好的已已经灭菌菌的一次次性塑料料杯子中中，搅拌拌匀，随随后用保保鲜膜封封住杯口口。 (33)将接种种后的酸酸乳
8、瓶置置于4042恒温箱箱中培养养344h。培养养时注意观观察，在在出现凝凝乳后停停止培养养。再转转入45的低温温下冷藏藏24h以上进进行成熟熟。 (4)以品尝尝为标准准评定酸酸乳质量量，将用用乳酸球球菌和乳乳酸杆菌菌等量混混合发酵酵的酸乳乳与单菌菌株发酵酵的酸乳乳相比较较，前者者的香味味和口感感更佳。品尝时时若出现现异味，表表明酸乳乳受杂菌菌污染了了。二、实验验实际操操作结果果1.平板板画线分分离结果果2.分离离涂布结结果继续纯化化（1）形形态特征征：分离离乳酸菌菌革兰氏氏阳性，不不运动、不形成成芽孢和和荚膜，大大小均在在标准范范围之内内。乳杆杆菌茵体体大小0.551.01.556 .0m，杆
9、状状，菌体体钝圆，单单在或呈呈链状存存在。嗜嗜热链球球菌大小小0，7 1m，球形形或卵圆圆形，多多成双，也也可呈长长链状存存在。（2）培培养特性性：在脱脱脂乳平平板培养养基上培培养2天后。干酪乳乳杆菌及及嗜酸乳乳杆菌菌菌落一般般13mm大小、圆形、边缘整整齐表面面光滑中中度隆起起、灰白白色或淡淡黄色。保加利利亚乳杆杆菌菌落落l3mm大小，两两面凸起起，星形形状。嗜嗜热链球球菌形成成点状茵茵落。在在脱脂乳乳平板培培养基上上培养2天后，三三种乳杆杆菌均为为无色的的羊毛状状粗糙的的小点状状菌落。嗜热链链球菌为为l 2mmm大小，光光滑微白白色有光光泽、两两面凸起起的菌落落。3.脱脂脂乳鉴定定及镜检检
10、结果由平板划划线分离离培养基上选选取的1、2、3号菌种种均能使使脱脂乳乳试管凝凝固（见见上图），分分别对其其进行革革兰氏镜镜检呈阳阳性，细细胞杆状状或链球球状，鉴鉴定为所所要菌种种，进行行斜面接接种纯化化镜检结果果：4.斜面面接种结结果5.酸乳乳发酵结结果混合菌发发酵后牛牛奶单菌发酵酵后的牛牛奶表乳酸茵茵单菌及及混合菌菌发酵的的酸乳品品评结果果乳酸菌类类品评项目目结论凝乳情况况口感香味异味pH值乳球菌部分凝乳乳较差较差有异味单菌发酵酵酸乳凝凝固情况况较差，为为了口感感和凝固固较好最最好用混混合菌发发酵！乳杆菌部分凝乳乳较差较差有异味乳球菌与与乳杆菌菌混合（1:1）牛乳基本本全部凝凝乳，凝凝乳较
11、好好甜味和酸酸味适中中较好无三、讨论论及结论论在实验中中开始我我们没有有采取厌厌氧措施施，结果果导致培培养分离离的培养养皿上杂杂菌较多多，镜鉴鉴后只有有极少量量的乳酸酸菌。后后来我们们采用保保鲜膜覆覆盖培养养基制造造厌氧环环境才培培养分离离到了较较好的乳乳酸菌种种，并经经镜鉴和和发酵最最终做出出了和市市场销售售酸乳风风味差不不多的酸酸乳。因因此在乳乳酸菌的的分离纯纯化与发发酵过程程中保证证厌氧环环境是十十分重要要的，不不必拘泥泥于传统统的实验验造作要要灵活运运用已有有材料才才能取得得良好的的结果。分离乳杆杆菌和链链球菌进进行的混合发发酵，比比使用单单一菌株株进行发发酵时产产酸快，产产酸性能能稳定，凝凝固均匀匀，无乳乳清析出出，芳香香风味好好，说明明乳制品品发酵过过程中使使用混合合乳酸菌菌发酵剂剂是应该该提倡的的。【参考文文献】1张张以芳，刘刘阴武等等.酸奶与与酸奶饮饮料中乳乳酸菌的的分离鉴鉴定及发发酵性能能试验 JJ2黄黄秀梨辛明秀微生物物学试验验指导 MM高等等教育出出版社 20008
