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1、项目编号大连理工大学大学生创新性实验计划项目申报书项目名称：人源脐血造血干/祖细胞的体外扩增项目负责人：所在院系：化工学院化学工程系指导教师：申请时间：2009 年6月29日教务处制表项目名称人源脐血造血干/祖细胞的体外扩增申请经费10000元起止时间负姓名院（系）专业班级学号联系电话责人化工学院化工英强参化工学院化工英强加成员指导教师姓名职称讲师学位 工学博士单位大连理工大学化工联系方式学院(同类研究工作国内外研究现状与存在的问题等)数量稀少的造血干/祖细胞(Hematopoietic stem/progenitor cells, HSPC s)是体内各种成熟血细胞的唯一来源，它主要存在于脐
2、带 血、骨髓和外周血中。HSPC驻治疗贫血等血液疾病、白血病等癌症病 人高剂量放化疗后的造血重建、基因治疗和免疫治疗以及制备成熟血液 产品等方面有极重要的临床应用价值，因此多年来一直得到科研工作者和临床医生的局度重视和关注。脐带血是目前临床上HSPCS勺重要来源，其富含更早期的 HSPCs免 疫原性弱、对异源性抗原产生的抗体少、成熟性T细胞较少、采集和保存容易、无肿瘤细胞污染、对供者无损伤及副作用、CD34CD38与CD34 CD33的比例较高等一系列优点，使彳#与脐带血有关的造血干/祖细胞的研究成为热点。然而，脐带血中HSPC的数量有限，无法满足临床移植的需要。近 年来不断发展的造血细胞体外
3、扩增技术，希望能通过在短时间内扩增细胞，来满足这一需求。但研究发现，添加大量细胞因子所扩增的HSPCs项目背景及研究意义常发生过度分化，输入体内后的移植效果不能令人满意。因此，寻找更 加合理的体外扩增手段，使造血细胞在体外大量扩增的同时，又能保持 其干/祖细胞的特性，是研究中要解决的关键问题。自干细胞的增殖发育存在于微环境的假说被提出，大量研究证明了干细胞生态位区的存在。低氧浓度也是骨髓造血niche区域的特征之一， 因此在HSPC辄外培养过程中，低氧环境也起到非常重要的作用。Smith和Koller等应用3%-7%勺低氧环境进行造血细胞的体外培养，发现这些 中度的低氧环境均能增加各系祖细胞的
4、产率，且不影响它们的分化与成熟。并推测是因为其氧浓度接近于体内造血环境的氧含量，比在常氧条 件下的培养体系能减少氧自由基的形成或增加细胞因子的生成。孙冰等进行了低氧和常氧条件下单核细胞和CD34细胞的半固体和液体培养，计细胞总数和集落产率，发现体外低氧环境能显着增加 CD34造血干/祖 细胞形成红系祖细胞的产率，且使其对细胞因子的依赖性降低，并对早 期红系祖细胞的维持有增强作用。体内造血过程是一个非常复杂而周密的调节系统，低氧所致造血细胞增殖、 分化和凋亡的改变是由一系列细 胞内信号转导、各种生物化学反应及相关基因表达改变的综合结果。有关微囊化基质细胞与造血干细胞共培养的研究，刘洋等在旋转壁式
5、反应器中进行了微囊化骨髓间充质干细胞支持脐血造血干/祖细胞体外扩增研究。但是到目前尚没有在低氧环境中采用微囊化的方法包埋 CD34细胞进行体外扩增的报道。本研究正是基于目前对CD34细胞和造血生态位区的最新认识，从工程学的角度设计出一种利用微囊化的 CD34细胞在低氧环境下培养的策略，实现造血干 /祖细胞的有效体外扩增。研究内容：1) 人源脐血造血干/祖细胞(HSPCS的体外分离和培养将从健康足月分娩产妇采集到的脐带血(含抗凝剂)缓慢叠加到Ficoll淋巴分离液上，两者体积比为1:12:1 o然后，进行密度梯度离心(2500r min 1,25 min),吸取中间白膜层。将吸取到的细胞用含有
6、10%胎 牛血清的D-Hank s平衡盐溶液离心洗涤两次 (1000 r min 1, 5 min), 之后调整密度接种到培养瓶中备用。研究内容和拟解决的关键问题2) 脐带血CD34细胞的分离和培养用免疫磁珠筛选分离法(magnetic activated cell sorting, MACS )分选CD34ffl胞。然后将分离出的CD34细胞接种到培养瓶中。在接种到6孔板共培养以前，CD34细胞在T形瓶中培养过夜，以适应体外生长条件。3)脐带血CD34细胞的微囊化培养a.首先进行载CD34细胞GAO囊的制备。将已经分离的CD34细胞进行传代培养以使其细胞数满足实验需求。然后取生长状态良好的C
7、D34细胞进行消化离心，加入明胶溶液 (2.0% w/v ,溶于DMEMf养基中)使 细胞重悬，调整细胞密度为 2X106cells mL1。在培养箱中孵育30 min, 使CD34细胞与明胶充分接触。按海藻酸钠：明胶=3:1的比例加入海藻酸 钠溶液(2.0% w/v),混合均匀后，加入到注射器中，此时细胞密度为5X105 cells mL1。开动微囊制备装置，在电压 6 kV,流速40 mL h 1条 件下，滴加1 mL细胞混合液到30 mL CaCl 2(1.1 % w/v)溶液中进行凝 胶化反应，形成载细胞明胶海藻酸钠微胶珠。然后将胶珠加到壳聚糖溶液(0.5% w/v)中覆膜反应10 m
8、in,形成载细胞GACB胶囊。用PBS洗涤 三次，再用无血清IMEM洗涤一次。b. CD34+细胞的微囊化培养。将制备好的微囊加到6孔板的一个孔中，并添加适量IMEMM养基。共制备6组微囊，分别在常氧(20%氧浓度)培养箱和低氧(5%氧浓度)培养箱中培养过夜，每种条件下设置3组进行平 行实验。将微囊化 CD34细胞接种于6孔板中，每孔添加3 mL,平行3 孔。低氧组记为a,常氧组记为a。培养基采用无血清IMEM添加少 量生长因子，包括 2.4 ng mL1 IL-3 , 10 ng mL1 FL, 20 ng mL1 SCF, 2.0 ng mL1 GM-SCF 3.2 ng mL1 TPO。
9、一共培养7 d,每天取样前轻轻 吹散细胞，使CD34细胞分泌的信号因子和造血生长因子等分散均匀， 每孔取0.2 mL细胞悬液进行各种检测，取样后补加相同体积的新鲜培 养液。另外，分别在常氧和低氧条件下进行CD34细胞单独培养作为对照，低氧组记为b,常氧组为bo培养和检测方法与微囊化培养组相 同。4)扩增后造血干/祖细胞的生物学鉴定a. 细胞计数：使用血球细胞计数板和台盼兰拒染法进行总有核细胞计数。b. CD34+细胞检测：使用CellQuest Pro流式细胞仪对新分离以及培养后的造血细胞(细胞数大于1.0 X106个/组)进行表面抗原检测。首先，用含有1%0台牛血清的PBS溶液将细胞离心洗涤
10、一次(1000 r min1, 5 min)。之后，加入 CD34抗体，并在4c下避光孵育30min。然后，再使用 PBS离心洗涤一次细胞(1000 r min1, 5 min),最后上 机进行检测。c. 集落形成检测：将扩增前的单个核细胞和扩增后的细胞分别以1 x 105 cells mL1的密度接种于甲基纤维素半固体培养基(MethoCult TM GF H4435. Stem Cell Technologies公司产品)中，内含30% FBS 10 g L 1牛血清白蛋白、104 mol L1 2-疏基乙醇、2 mmol L1 L-谷氨酰胺、SCF50 ng mL1、IL-3 20 ng
11、 mL1、IL-6 20 ng mL1、GM-CSF 20 ng mL1、G-CSF 20 ng mL1 和 EPO 3 U mL1,于 37 C、5% CQ 饱和 湿度下培养7 d和14 d后计数CFU-Csd.数据统计分析：实验中统计数据以 meant SD表示，两组间比较采用t检验，四组间比较选用双因素方差分析， 用Origin7.5 软件进 行统计分析。拟解决的关键问题1）人源脐血造血干/祖细胞包囊的最佳接种密度;2）细胞生长因子的最佳使用浓度。项目创 使用微囊化方法包埋造血干/祖细月ft （ CD34细胞）进行体外扩增新之处（查阅资料、选题、自主设计项目研究方案、开题报告、实验研究、
12、数据统计、处理与分析、研制开发、填写结题表、撰写研究论文和总结报告、参加结题答辩和成果推广等）2009年9月1日2010年2月29日：查阅资料、选题、自主设计项目研究方案、开题报告、实验研究； 项目进进行人源脐血造血干/祖细胞的 度安排体外分离和培养以及 CD34细胞的分离和培养；2010年3月1日2010年8月31日：进行CD34细胞的微囊化培养，并完成扩增后造血干/祖细胞的生 物学鉴定；填写结题表、撰写研究论文和总结报告、参加结题答占、占 辨。项目经费预算（如材料费、资料费、版面费、专利费、调研费等）材料费：4000元资料费：1500元版面费：1500兀专利费：1500元调研费：1500元
13、经费预算总计：10000元预期研究成果（如项目鉴定、学术论文、申请专利、获奖、推广应用等）预期发表SCI论文1-2篇。指导教帅息见（从项目学科性、前沿性、可行性、研究性、可操作性和成效性加以评价）本项目针对当前国际造血干细胞领域的热点，在体外分离培养脐带血造血干/祖细胞的基础上，将细胞微囊化的体外扩增技术与造血干 /祖细胞 的相关研究内容有效结合，具有很好的前沿性、创新性和可行性。止匕外， 本课题研究思路清晰、新颖，目标明确，可操作性强，具有较好的基础研究价值，可为体外收获充足的造血干 /祖细胞以尽快应用于临床治疗 相关的血液类疾病打好坚实的基础。指导教师签字：年 月日所在院系意见负责人签字：（公章）年 月日学校评审意见签章：年 月日
