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1、橡胶树抗白粉病相关防卫基因的克隆及转hpa1_(Xoo) 基因植株再生体系的建立巴西橡胶树 (Hevea brasliensis)是天然橡胶的主要来源 , 在国民经济中具有举足轻重的地位。橡胶树的种植和生产常受白粉病的严重威胁, 白粉病是世界范围内危害橡胶树的三大病害之一, 发病严重时导致新梢枯死、 胶乳减产 , 种子失收。选育橡胶树抗病品种对我国植胶业的发展显得非常重要。但目前关于橡胶树应对白粉菌的防卫机理和相关抗病基因的表达调控还知之甚少。不断挖掘优良的橡胶树抗白粉菌基因, 是阐明橡胶树与白粉菌互作的分子机理 , 高效利用遗传育种手段对橡胶树进行抗病育种优化的基本前提和基础。本研究通过 m
2、RNA差异显示技术构建白粉菌侵染不同时间段橡胶树抗病品系RRIC52基因差异表达的 EST文库 , 利用 qRT-PCR分析 DDRT-PCR获得的 EST在橡胶树不同抗感病品系的差异表达 , 结合已公布的橡胶树基因组信息, 克隆获得防卫相关抗性基因 , 利用烟草转基因技术对差显获得的抗性基因HbFer 进行功能分析和验证 ,同时探索以 hpa1Xoo为目标基因 , 初步建立了橡胶树抗病转基因体系, 为差异显示筛选得到的抗性基因顺利转入橡胶树提供技术保障。具体研究结果如下 :1. 构建橡胶树受白粉菌侵染不同时间段诱导表达基因的EST文库 (GenbankNo.LIBEST-028598), 共
3、获得差异条带 300 余条。通过二次 PCR、反向 Northern 、测序分析等方法共筛选获得差异表达的ESTs序列 78 条。利用 NCBI中 Blastx同源检索进行比对分析 , 该 78 条 ESTs涉及 7 个功能分类 , 分别为细胞壁与细胞膜途径、转录因子和调节蛋白、转运、信号转导、植物抗毒素的生物合成、其他代谢机制和功能未知等。其中7 条 ESTs序列与转录因子和调节蛋白相关 ,10 条 ESTs序列参与运输活性 ,16 条 ESTs序列参与信号传导 ,11 个 ESTs参与植物抗菌物质的生物合成 , 这些功能途径在橡胶树抵御白粉菌侵染的过程中可能发挥着重要作用。2. 用 qRT
4、-PCR技术进一步验证了在橡胶树抗病品系 RRIC52和中感品系热研7-33-97 中具有显著差异表达的8 条 ESTs序列。通过 BLAST比对 , 从巴西橡胶树基因组克隆得到四个基因的开放阅读框(ORF)。进一步的生物信息学分析表明, 这四个基因分别为铁蛋白基因、几丁质酶基因、 WRKY转录因子、 Cupin1 基因的同源基因。推测这些基因在橡胶树中可能参与了植物防卫机制的调控。3. 从橡胶树 RRIC52品系中克隆得到 HBOH4全长 cDNA序列 (GenBank No.JZ822680), 鉴定为橡胶树铁蛋白基因 , 命名为 HbFer。该基因全长 1027bp, 开放阅读框 789
5、 bp, 编码 262 个氨基酸。为验证该基因功能 , 构建植物表达载体 EHA105:pCAMBIA1304-HbFer,利用农杆菌介导法转化烟草叶片 , 经过 PCR、RT-PCR、基因组 Southern 及经报告基因GUS组织化学染色等 , 确定该基因插入了烟草染色体基因组中并得到正确表达。接种棉花炭疽菌 (Glomerellagossypii)进行抗性检测 , 转基因烟草表现出一定的抗病性 , 说明 HbFer 基因可能在橡胶树抗性反应中发挥着重要作用。4. 为探索橡胶树抗病遗传转化体系 , 以 pCAMBIA2301为植物表达载体 ,hpa1Xoo 基因为目的基因 , 利用农杆菌介导转化橡胶树热研 7-33-97 花药愈伤组织 , 经过 PCR、报告基因 GUS组织化学染色和 PCR-Southern 验证 , 确定获得阳性植株。该体系的建立为 mRNA差异显示筛选获得的抗性基因的顺利转化橡胶树 ,以及抗病遗传转化改良橡胶树提供了技术保障, 进一步为深入研究橡胶树对白粉菌的防卫机制奠定了基础。
