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1、DNS比色法测还原糖标准曲线绘制及测定Tr21培养液中初始和最终还原糖及总糖含量实验报告1. 研究背景 木霉菌在发酵过程中，利用碳源导致发酵液中糖含量的变化，其中还原糖是一个 主要的反映参数。还原糖与3, 5-二硝基水杨酸（DNS）在碱性条件下生成棕红 色物质（3-氨基-5-硝基水杨酸），在一定范围内，棕红色物质颜色深浅的程度与 还原糖的含量呈一定的比例关系。糖含量的不同变化一定程度上体现着Tr21不 同的生长阶段，从而为控制及优化发酵过程提供科学依据。2. 实验目的3, 5-二硝基水杨酸比色法测定Tr21发酵液中还原糖含量，利用糖含量这个参数, 控制发酵过程。3. 实验原理在NaOH和丙三醇
2、存在下，3,5 二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被 还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm 波长处有最大吸收,在一定的浓度范围内,还原糖的量与光吸收值呈线性关系, 利用比色法可测定样品中的含糖量。（3 -氨基-5-硝基水杨酸）OH NO2HOOC+还原糖NO2(DNS)黄色桔红色4. 实验材料发酵液（5 天）：Tr121 （A2）实验材料： 3， 5-二硝基水杨酸，氢氧化钠，苯酚，亚硫酸钠，酒石酸钾钠，葡 萄糖，蒸馏水实验器材：可见分光光度计，电子天平，真空干燥箱，数显恒温水浴锅，离心机， 移液器，枪头，500ML容量瓶，试管，500 ml烧杯，100
3、0ml量筒5. 实验方法5.1 试剂配制（1）1 mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸 馏水溶解后，以蒸馏水定容至100m 1，即含葡萄糖为1.0mg/ml。（2）3,5二硝基水杨酸试剂：称取6.3 g 3,5二硝基水杨酸并量取262 ml 2mol/L NaOH加到酒石酸钾纳的热溶液中（182 g酒石酸钾纳溶于500 ml水中），再加 5 g结晶酚和5 g亚硫酸氢钠溶于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000 ml贮于棕色瓶中。(3) 碘一碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。(4) 6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏
4、水中。(5) 0.1% 酚酞指示剂。( 6) 6 mol/L HCl 溶液5.2 、葡萄糖标准曲线制作取8支15mmx180mm试管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。管号试剂012345678葡萄糖标准液00.20.40.60.81.01.21.41.6(ml)蒸馏水2.01.81.61.41.21.00.80.60.4(ml)水杨酸溶液1.51.51.51.51.51.51.51.51.5(ml)葡萄糖含量00.20.40.60.81.01.21.41.6(mg)将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀。入
5、 00.077 0.2 0.319 0.424 0.543 0.655 0.761 0.856=540nm处测定吸光度以葡萄糖含量(mg)为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线，如图一：5.3 .1 培养液中初始总糖与还原糖的测定准确量取5ml培养液，定容至50 ml，作为还原糖测定样品液。准确量取1ml发酵液并加蒸馏水定容至10ml放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 10ml，在沸水浴中加热0.5h,取出12滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液 检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后加入 1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到50ml
6、，用于总糖测定。试剂空白还原糖总糖样品溶液(ml)01.01.0蒸馏水(ml)2.01.01.0水杨酸(ml)1.501.501.50将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min,取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀。入=540nm处测定吸光度00.3110.228样品溶液中还原糖和总糖00.5940.445.3.2 发酵液中最终总糖与还原糖的测定发酵液2500rpm离心20min，取5 ml，作为还原糖测定样品液。准确量取5ml发酵液悬液放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 5ml,在沸水浴 中加热0.5h，取出12滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否
7、完全。 如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后加入1 滴酚酞指示剂，以 6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到50ml，用于总糖测定。试剂空白还原糖总糖样品溶液(ml)01.01.0蒸馏水(ml)2.01.01.0水杨酸(ml)1.501.501.50将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀。入=540nm处测定吸光度00.150.014样品溶液中还原糖和总糖00.2990.05测定后，取样品的光吸收值在标准曲线上查出相应的糖量。6.结果处理按下式计算出样品中还原糖和总糖的浓度：还原糖浓度(g/ml) = m /V*稀释倍数/1000 总糖浓度(g/ml) = m /V*稀释倍数*0.9/1000 式中：m一反应液中还原糖或总糖的质量：mg；V反应液的体积：ml； 1000mg换算成g的系数。得： 初始培养液中：还原糖浓度（g/ml） =0.594/1*10/1000=5.94/1000总糖浓度（g/ml）=0.44/1*50*0.9/1000=19.8/1000最终培养液中：还原糖浓度（g/ml）=0.299/1*1/1000=0.299/1000总糖浓度（g/ml）=0.05/1*10*0.9/1000=0.45/1000图一：DNS比色法测定还原糖标准曲线
