病理学实验技术重点

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1、1 .什么是病理学技术？病理学技术（组织标本切片和染色技术）是组织学、病理学等学科用于观察和研究组织与细胞的正常形态及病理变化的常用方法。2 .组织制片的目的。生物学标本在生活状态下多为无色透明，而且组织一旦离开机体后很 快就会死亡，其结构就会失去正常状态，必须对组织采取固定、切片 和染色措施！3 .何谓组织制片技术？组织经过固定、切片和染色后，光波通过被检组织成分时，波长和振幅发生改变，在显微镜下能清晰的观察其组织结构，称之为光镜标本的基本制作方法或称为组织制片技术。4 .组织制片种类及其各类方法的分类。（一）组织非切片制作方法:组织分离标本组织活体标本组织 涂片标本磨片标本整体封存（压片）

2、标本组织铺片标本组织 印片标本等（二）组织切片法:1.石蜡切片法 2.火棉胶切片法 3.冰冻切片法4.超薄切片法（电镜技术）5.树脂切片 6.碳蜡切片5 .组织制片的主要程序。取材、固定脱水-透明、浸渍-包埋、切片-贴片、染色- 浸洗脱水透明封固6 .实验动物处死常用方法及优缺点。1）挥发性麻醉剂（吸入麻醉）包括：乙醚、氯仿等。优点：乙醚吸入麻醉适用于各种动物，安全度亦大，动物麻醉深度容易掌握。缺点：是对局部刺激作用大，可引起上呼吸道粘膜液体分泌增多、肺部充血，再通过神经反射可影响呼吸、血压和心跳活动，并且容易引起窒息， 故在乙醚吸入麻醚时必需有人照看， 以防麻醉过深而致动物死亡。2）非挥发性

3、麻醉剂（注射麻醉）这类麻醉剂种类较多，包括10%苯巴比妥钠、4%戊巴比妥、5%硫喷妥钠等巴比妥类的衍生物，20%氨基甲酸乙脂（乌拉坦）和1%水合氯醛、氯胺酮等，可通过肌肉注射、静脉注射、腹腔注射。优点：这些麻醉剂使用方便，一次给药可维持较长的麻醉时间，麻醉过程较平衡，动物无明显挣扎现象。3）断髓（脱臼）法动物处死过程中动作要迅速，尽量避免其长时间处于痛苦或濒于死亡状态，以免机体内组织或细胞结构发生改变引起人工假象。4）空气栓塞法适用于较大的动物，如兔、猴、犬等。迅速方便，但可使内脏器官或多或少的呈现瘀血，如心内膜下瘀血、肝血窦扩张7 .组织取材注意事项1 .材料保持新鲜：2.标本大小适宜：3.

4、勿使组织块受挤压：4.尽量保 持组织的原有形态：5.选好标本切面：6.保持材料的清洁：7.切除不 需要部分8.明确编号，登记8 .什么是固定，其意义及目的？固定：是指从人体内或动物体内取下的材料立即浸泡在化学试剂 中，借助化学试剂的作用，将组织细胞结构保存起来，使其形态结构 近似生活状态的一种手段。意义保持细胞、组织的固有形态和结构目的（1）防止标本的自溶与腐败，以保持组织细胞的固有形态。（2）使组织细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种物质成份沉淀或凝固成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。（3）可增强染色的作用。使组织中的各种物质沉淀凝固而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后

5、易于鉴别和观察。（4）固定剂兼有硬化 作用，使组织硬化，增加组织硬度，便于制片。（5）防止细胞过度收 缩或膨胀而失去其原有形态结构。另外，对某些具有传染性的标本，能防止疾病的扩散。固定的作用：防止组织的自溶与腐败使细胞内蛋白质凝固保持组织的固有形态和结构保持组织或细胞的抗原性9 .常用的固定方法。蒸汽固定法 、标本固定（侵泡固定） 、 灌流固定 （局部固定-心脏、睾丸、肺，全身固定（ 灌注量 和 灌注压 是全身灌注过程最重要的两个因素。 ） -适用于缺氧敏感的组织） 、涂片固定（侵泡固定、滴液固定） 、散在细胞固定、微波固定10 .影响固定的因素及注意事项？1 .组织固定必须新鲜：无论取人体或

6、动物组织， 都必须立即投入固定剂。2.防止组织因固定剂的作用而发生变形：3.标本大小：在保证形态结构完整性的同时，厚度不超过5mm。 4.固定液的量：一般为组织块体积的 20-30 倍（不得少于标本体积的 5 倍） 。 5.固定时间：根据组织的种类、 大小， 固定剂种类、 性质、 渗透力的强弱而定。 6.固定温度： 室温 （ 20-25 ） 或低温 （如4）， 一般不应超过40-45 。7.选择适当的固定液：8.促使固定：11.常用的固定剂有哪些？1、单纯固定剂 甲醛37% -40 %的甲醛水溶液，即市售福尔马林、 37% -40 %甲醛当做100%哥尔马林10mL班储水90m毗液实际上为4

7、%甲醛水溶液、多聚甲醛、乙醇、醋酸、苦味酸、钺酸、丙酮、重铭 酸钾、戊二醛等2 、 混合固定液Karnoversy s 改良液、 Bouin 液、 Zenker 液、 A-F 液（乙醇 - 甲醛液）、Carnoy 液、Zamboni液、PLP 液12.什么是脱水？常用脱水剂利用某种化学试剂逐步将标本内部吸收的水分置换出来，以使标本处于无水状态，这一过程叫脱水。脱水剂的种类1 .单纯脱水剂：如乙醇、丙酮和甲醇。其组织在脱水后必须再经二甲苯透明才可浸蜡。常用乙醇2 .脱水兼透明剂：如正丁醇、叔丁醇等，组织在脱水后即可直接透蜡，不必经过中间 溶剂如二甲苯之类的试剂。13定义：透明、浸透、普通染色、特

8、殊染色、单一染色、复染色、多种染色透明：组织块中的脱水剂被有机溶剂取代， 其折射指数接近于 组织蛋白的折光指数，组织块变得透亮，因此称之为透明。透明剂有：二甲苯、苯、甲苯、氯仿等。浸透：用浸透剂（如石蜡、火棉胶、碳蜡和明胶等）渗入组织 内部的过程。普通染色：最广泛应用的是苏木精和伊红染色， 又称常规染色。特殊染色：为显示特定的组织结构或其他的特殊成分。单一染色：选用一种染料对组织或细胞中的某一种结构或成分的染色。复染色：衬托主染色所进行的染色。多种染色：如荧光染色，可用不同颜色的荧光染料标记不同的成分。14 石蜡包埋程序。1）组织取材，于固定剂固定。2 ）组织洗涤6-12h。 3）脱水：70酒

9、精 1-3h 80%酒精 1-3h。 90%酒精 1-3h。 95%酒精（I、II） 1-3h。100%酒精（I、H、田）1-2h。 4）透明：二甲苯（I）5-30min。（二甲苯（H） 5-30min）。5）浸蜡（I、H ） 2h。 6）组织包埋15冰冻切片步骤（切片前/后固定）。固定过的组织 切片前固定1 、新鲜组织取材2、 4%甲醛固定 2h 或以上3、入 15%、 20%、30%蔗糖溶液（ 0.1M PBS， pH7.4） ，浸泡至组织块沉底4、冰冻切片机切片5、贴片，风干，冰箱保存备用6、染色切片后固定：1 、新鲜组织取材 2 、 （立即置入超低温冰箱/液氮冷冻2min （锡箔纸包裹

10、后冷冻， 用于组织的保存） 3、 用 OCT 包埋在冰冻头子上4、切片0.530微米，附于载（盖）玻片上5、冷风吹干/固定 冷固定液（-4C）,固定2-10min.室温固定30-60sec.固定液：丙酮、 Carnoy 液、甲醛-乙醇、4%中性甲醛等 16 石蜡切片 HE 染色步骤。1.常规石蜡切片(1)脱蜡至水：二甲苯I :卜各5-10min二甲苯n(510) minx 2或3次 100叱醇L 各510min95充醇90叱醇80叱醇 70叱醇蒸储水浸洗25min(2)苏木精染色：苏木精1-10min。自来水流水冲洗。0.5%盐酸-乙醇分色，数秒-数十秒。自来水快洗。0.5%氨水蓝化，30se

11、c-1min,自来水冲洗光镜下镜检细胞核分色程度。自来水流水冲洗3min。(3)伊红染色： 1%伊红 1-10min。蒸储水快洗。5.脱水、透明和封固:70%、80%、90%乙醇速洗,每级数秒-数十秒。95%30sec-1min光镜下监控细胞核与细胞质颜色对比。 100%乙醇，3-5min, 2 次。二甲苯 I、H，各 5-10min。封片:中性树胶17冰冻切片HE染色步骤。2.冰冻切片(1) 冰冻切片10卿醛固定流水冲洗1-5min2min3min蒸播水浸洗(2)苏木精染色：H Harris苏木精1-5min。自来水快洗。0.5%盐酸-乙醇分色，1-2sec。自来水快洗。)0.25%-0.5

12、%氨水蓝化，几秒-十几秒，自来水冲洗。)光镜下镜检细胞核分色程度。(3)伊红染色：1%伊红1-5min蒸储水快洗。5.脱水、透明和封固：70%、80%、90%乙醇速洗,每级数秒-数十秒。95%30sec-1min光镜下监控细胞核与细胞质颜色对比。 100%乙醇，3-5min, 2 次。二甲苯I、H，各3-5min。封片:中性树胶18、组织化学定义及特征。是基于已知的化学反应，在组织或细胞原位上显示出组织或细 胞中的化学物质，并研究其化学性质及功能关系的一门技术。组织化学的特征：应用物理的和化学的方法来查明细胞或组织的化学成分；用组织学、化学、物理学原理，研究细胞或组织的结构、功能与化学的关系；

13、对细胞或组织成分的定位、定性、定量的特征进行研究，来认识细胞或组织结构与功能的关系。具有较强的特异性。19、组织化学基本步骤及基本要求。基本要求（1）保存组织（细胞）在生活状态下的结构；（2）保存组织（细胞）内的生前化学成分、酶活性及检测目的物；（3）所使用的染色方法是按照已知的化学或物理反应原理进行。（4）反应产物应在组织结构上形成稳定的有色沉淀物质。( 5)检测手段要有高度的敏感性、特异性和可重复性。( 6)生成物的反应产物必须在原位沉淀，保证定位的精确性及稳定性。基本步骤 冰冻切片或石蜡切片等常规处理(同普通制片)进行组织(细胞)化学染色在光镜下观察20、组织化学染色方法分类。纯化学方法

14、： Schiff 反应法、偶氮偶联法、金属沉淀法、联苯胺反应、四唑盐反应类化学反应：属某些特殊染色技术，如：Best 洋红染色显示糖原Baker酸性苏木精染色显示磷脂Mayer黏洋红与黏苏木素显示黏蛋白物理学：脂融染色法、荧光分析、放射自显影21、显示核酸、糖原、脂类物质常用的方法。糖类物质的显示方法：PAS显示法(Periodic Acid Schiff)、 阿利新蓝法(Alcian Blue)阿 利新蓝 -PAS 复合法( Alcian Blue-PAS) 、 胭脂卡红法( Carmine method)、甲苯胺蓝法、硫堇法等核酸显示法1 、 显示 DNA ： Feulgen 法试剂： S

15、chiff 试剂、盐酸、亚硫酸氢钠2 、 核仁组成区和酸性粘多糖复合显示法：试剂： 2%的甲酸、 2%的明胶、 50% 的硝酸银、阿申蓝（ 8GX ） 、醋酸溶液3 、 粘多糖和核仁组成区双染法试剂： Schiff 氏试剂、胶性银液4、RNA和DNA的甲绿-派若宁显示法试剂：甲绿、派若宁脂类显示1、单纯脂质：如中性脂肪，油及蜡等，苏丹染料可染为黑色或红色。2、复合物质：如醇类，脂肪酸，磷酸和含氮的碱基等。复合脂质分为磷脂和糖脂。磷脂：卵磷脂，脑磷脂和神经鞘磷脂。苏丹黑染色为阳性，PAS反应为阴性。糖脂：PAS反应呈阳性。衍生脂质： 指尚具有脂质性质的单纯脂质或复合脂的水产物， 属于这类的有脂肪酸和固醇类。脂肪酸：硫