《牛支原体0580基因C端截短体的原核表达及生物学功能初步分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《牛支原体0580基因C端截短体的原核表达及生物学功能初步分析（15页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 牛支原体0580基因C端截短体的原核表达及生物学功能初步分析 荆婷婷,尹 号,黄 蓉,兰仕梅,李章程,尤留超,郝华芳,付 磊,储岳峰(中国农业科学院兰州兽医研究所,兰州大学动物医学与生物安全学院,动物疫病防控全国重点实验室,兰州 730000)牛支原体属于柔膜体纲、支原体属,是介于细菌和病毒之间的自然界存在的最小的最简单的能进行自我复制的原核微生物。目前已分离鉴定出与牛病相关的支原体有20多种,牛支原体是其中一种。1961年,美国人Hale首次从患乳腺炎的病牛中分离到牛支原体,1967年,发现其与牛呼吸道疾病有关,并被命名为Mycoplasmabovis1,我国湖北省于2008年首次暴发了由
2、牛支原体引起的犊牛“烂肺病”,发病率高达50%100%,死亡率可达10%50%,严重损害了我国养牛业的健康发展2-3。更多研究表明牛支原体能引起牛肺炎、乳房炎、关节炎、结膜炎等多种疾病,还可与其他病原一起引起混合感染4-6,已给全球养牛业以及乳制品业造成了巨大经济损失7-8,开展其致病机制研究及开发防控产品一直是科学工作者们研究牛支原体的热点方向。牛支原体主要通过黏附宿主组织细胞来实现在机体中的定殖,进而破坏宿主免疫屏障。通过抑制宿主免疫、释放毒素物质、掠夺宿主营养物质等途经造成宿主损伤9-13。此外,在牛支原体膜表面存在着结构和功能的多样性可变脂蛋白家族(Vsps),有助于牛支原体躲避宿主免
3、疫系统的识别。除了这些,牛支原体还存在一些毒力因子,如膜蛋白核酸酶,能诱导宿主细胞的凋亡14。早在1968年就有研究表明多种支原体具有溶血毒性,如肺炎支原体、鸡毒支原体、猪鼻支原体、绵羊肺炎支原体等15-18。孙远航等18原核表达了绵羊肺炎支原体Y98株的溶血素(hemolysin)HlyA基因,并证明了该蛋白具有溶血活性。猪鼻支原体通过同源重组定向缺失技术确定了与溶血相关的基因HlyC20。本研究发现牛支原体模式菌株PG45以及08M、07801临床分离株对鼠红细胞有溶解能力,进而根据NCBI上的基因注释及序列比对找到假定的可能与溶血素相关的基因MBOVPG45_0580。通过对0580的氨
4、基酸序列以及核苷酸序列进行分子特征分析,发现该蛋白氨基酸序列在牛支原体多种菌株中的保守性极高。通过原核表达外源性0580蛋白的C端截短体、制备其多克隆抗体、溶血试验、黏附试验等,初步分析MBOVPG45_0580在牛支原体致病机制中的生物学作用。1 材料与方法1.1 材 料1.1.1 菌株、载体及实验动物 大肠杆菌感受态DH5、BL21(AI),表达载体Pcold III,牛支原体PG45、08 M、07801菌株均来自本实验室。实验动物为6周龄BALB/c雌性小鼠,由中国农业科学院兰州兽医研究所动物实验中心提供。1.1.2 主要试剂材料 氨苄青霉素(100 gL-1)、IPTG诱导剂、咪唑、
5、TBST、PBST、脱脂奶粉、牛血清蛋白(BSA)、LB培养基(胰蛋白胨10 gL-1、酵母提取物5 gL-1、氯化钠10 gL-1)、TAE电泳缓冲液(2 mmolL-1Tris、1 molL-1乙酸、100 mmolL-1EDTA)、SDS电泳缓冲液(0.025 molL-1Tris、0.25 molL-1Glycine、0.5% SDS)、转膜缓冲液(48 mmolL-1Tris、39 mmolL-1Glycine、0.037%甲醇)等购自北京索莱宝科技有限公司;HigH Affinity NI-NTA Resin购自金斯瑞生物科技公司;蛋白质分子量标准、Super Signal Wes
6、t Atto超敏底物购自赛默飞尔而科技公司;HIS标签鼠源抗体、HRP标记的羊抗鼠抗体购自生工生物工程(上海)股份有限公司;DL 5000/2000 DNA marker、Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶等试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、T4连接酶、Nde限制性内切酶、Xba限制性内切酶购自TaKaRa公司,CFDA SE细胞增殖与示踪检测试剂盒与DAPI核染料购自上海碧云天生物技术有限公司,鬼笔环肽染料购自美国Cytoskeleton公司。1.1.3 主要仪器 CO2培养箱购自赛默飞生物科技有限公司,生物安全柜购自苏州安泰公司,P
7、CR仪、垂直电泳系统、凝胶成像系统购自Bio-Rad公司,水平核酸电泳系统购自北京六一有限公司,激光共聚焦显微镜购自德国徕卡公司。1.2 生物信息学分析以及同源性分析以牛支原体PG45菌株基因组DNA为模板,从GenBank数据库查找PG45菌株0580蛋白的氨基酸序列(GenBank登录号:WP_013456244.1),将氨基酸序列上传至在线分析软件ProParam、ProScale analysis、SignalP 6.0,TMHMM Server 2.0,预测蛋白的理化性质、分子量大小、跨膜区等参数。利用DNAStar软件对0580蛋白的氨基酸序列、亲疏水区进行分析,筛选主要结构域。从
8、NCBI数据库中收集支原体0580的氨基酸序列,采用MEGA 6.0软件进行氨基酸序列分析,并以此构建进化树。1.3 引物设计以及重组蛋白0580-C原核表达载体的构建将0580蛋白氨基酸序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司按照大肠杆菌偏爱密码子进行密码子优化并进行基因合成,以便更容易在大肠杆菌中进行可溶性表达。通过Primer Premier 5.0软件设计扩增0580截短的C端基因的特异性引物,上游引物:0580-C-NdeI-F:5AAACATATGGGCA-AGATCGGTCGTAATATTTACATCAC 3;下游引物: 0580-C-His-XbaI-R:5TTTTCTAGAT
9、CA-GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTATC 3,预期扩增片段长为894 bp。PCR扩增0580-C片段,电泳后进行胶回收纯化。用限制性内切酶Nde、Xba分别对纯化产物和Pcold III载体进行双酶切,使用T4连接酶将酶切后的片段与载体过夜连接,转化到大肠杆菌感受态DH5中,挑取菌落进行PCR鉴定,筛选出的阳性克隆进行测序。1.4 重组蛋白0580-C的诱导表达与纯化取50 ng测序完全正确的重组质粒转化入BL21(AI)表达菌株中,挑取单克隆于带有100 gmL-1氨苄青霉素抗性的3 mL LB培养基中进行复壮后转接,待菌液OD值到达0.60.8时,分别加入至终浓
10、度为0、8、0.8、0.08 mmolL-1的IPTG诱导剂,于16 ,120 rmin-1,诱导30 h。收集菌体,经超声破碎仪破碎后,制备上清液蛋白样和沉淀蛋白样。经过SDS-PAGE电泳染色后,观察蛋白是否表达,上清中蛋白表达量最多的则为最佳诱导剂浓度。使用最适表达条件进行大量诱导产生蛋白,采用NTA树脂进行亲和层析纯化。对纯化后蛋白进行超滤浓缩,使用Bradford法测浓缩后蛋白浓度检测浓缩后蛋白浓度。1.5 重组蛋白0580-C的鉴定将重组蛋白0580-C(rMbovP0580-C)以10 L孔-1上样,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,先用80 V电泳30 min再换成120 V继续跑胶1
11、h。通过湿式转印法将蛋白转印到PVDF膜上,电压为100 V,时间为1 h。将PVDF膜使用5% BSA在室温条件下封闭2 h后,使用商品化的鼠源一抗(HIS)按照15 000稀释,室温孵育1 h,使用TBST洗涤3次,10 min一次。再用HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗按照15 000稀释,孵育1 h后洗涤,使用ECL进行显色。1.6 多克隆抗体的制备与效价测定在免疫前,对5只6周龄BALB/c雌性小鼠进行尾静脉采血,制备血清。首次免疫时,将纯化的蛋白与完全弗氏佐剂等体积充分混合形成油包水乳化剂,皮下多点注射进行免疫,免疫剂量为100 g只-1。之后第14、21、28、35天分别进行免疫,使
12、用不完全弗氏佐剂与纯化的蛋白等体积混合,免疫剂量不变。最后两次免疫采用腹腔注射。第五次免疫一周后对小鼠进行眼眶静脉丛采血,分离血清,所得即为针对0580-C重组蛋白的鼠源多克隆抗体。取12.5 g纯化后的重组蛋白0580-C作为抗原进行包被,于4 过夜孵育后,使用5%脱脂奶粉(0.137 molL-1NaCl,0.02 molL-1Tris,50 gL-1脱脂奶粉)37 封闭2 h。使用PBST洗涤3次,每孔300 L,每次3 min。将获取的阳性以及阴性血清使用PBST从1800开始二倍比稀释进行孵育,每孔100 L,37 孵育1 h,洗涤后使用HRP标记的山羊抗鼠IgG(稀释倍数为110
13、000)100 L孔-1再次孵育1 h。孵育结束后进行洗涤,使用显色液、终止液进行显色。最后用酶标测定仪在450 nm 处读取OD值。待测血清OD450 nm的数值记为S,阴性对照血清测定的OD450 nm数值记为N,S/N2.1即为阳性,以能获得阳性的最大稀释比例作为待检血清的抗体效价21。1.7 重组蛋白0580-C的免疫印迹检测将rMbovP0580-C以10 L孔-1上样,进行SDS电泳后转印到PVDF膜上,加入含有5% BSA的封闭液进行孵育;rMbovP0580-C的鼠源多克隆抗体按13 000稀释后作为一抗,于摇床上(100 rmin-1)室温孵育1 h,使用TBST洗涤后再用H
14、RP标记的山羊抗鼠IgG二抗按照110 000稀释,孵育1 h后洗涤,使用ECL进行显色。1.8 重组蛋白0580-C内源性表达鉴定以19的比例复苏牛支原体PG45、08 M、07801菌株,再转接至200 mL MTB培养基中,37 培养7284 h,集菌破碎后制备蛋白样,以10 L孔-1上样,进行SDS电泳,转印。加入含有5% BSA的封闭液进行孵育;将制备的rMbovP0580-C鼠源多抗按照11 000稀释后作为一抗孵育1 h,洗涤后再用HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗按照110 000稀释,孵育1 h后洗涤,使用ECL进行显色。1.9 重组蛋白0580-C的溶血性试验将200、400
15、g纯化超滤后的rMbovP0580-C分别与等体积的2%鼠红细胞悬液混合,于37 温箱中孵育3 h,观察是否有溶血现象发生。1.10 重组蛋白0580-C对PG45菌株黏附EBL细胞能力的影响参考Zou等22、Zhu等23的研究方法设计蛋白对牛支原体黏附力影响的试验,并进行优化。1.10.1 菌落计数法1.10.1.1 支原体及细胞准备:将培养至对数生长期的牛支原体以12 000 rmin-1离心10 min,使用PBS洗涤3次后采用DMEM(无抗含血清)重悬,进行计数。将胎牛肺细胞(EBL)铺于12孔板中,待其生长至每孔约80%时,以DMEM(无抗无血清)洗涤3次并随机选取一孔使用胰酶消化计
16、数。其余孔洗涤后加入细胞培养基。1.10.1.2 细胞感染:感染量为每个细胞接种100个支原体,在阴性对照组加入400 g BSA蛋白,试验组加入400 g rMbovP0580-C,使用DMEM(无抗含血清)将每孔加液量补至1 mL,混匀后放到含5% CO2的37 温箱中感染EBL细胞1.5 h。1.10.1.3 计数:感染结束后,使用预热的PBS洗去未黏附的牛支原体,加入胰酶消化细胞,用细胞培养基终止消化并充分吹打细胞。取100 L加入到900 L PBS中,进行梯度稀释,取10-3、10-4稀释度悬液各100 L涂布牛支原体固体培养基,置于37 培养箱培养35 d后对菌落进行计数。试验设置牛支原体PG45感染组(空白组)、PG
