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1、 基于“苦坚肾”理念对黄柏改善糖尿病肾病足细胞损伤的机制研究* 赵 丽,王锁刚,马继伟,浩 飞(河南中医药大学第一附属医院,河南 郑州 450000)糖尿病肾病(diabetes nephropathy,DN)是糖尿病患者最严重的并发症之一,也是造成糖尿病患者死亡的主要原因1。DN的组织病理学改变包括肾小管间质纤维化、肾小管炎性浸润、肾小球硬化等2,其中肾小球硬化可致肾小球滤过功能损伤。足细胞在维持肾小球滤过膜通透性方面起到重要作用,其数目与结构的完整性是肾小球滤过作用正常的基础,足细胞数目、形态、功能一旦出现异常会引起肾小球滤过屏障损伤而致肾小球滤过率降低,继而引起蛋白尿,并诱发肾损伤,推动
2、DN疾病进展3。临床研究4表明:高糖环境可对肾小球滤过膜造成直接与间接损伤,可导致足细胞数目减少并从基底膜脱落。残余的足细胞为覆盖基底膜会出现足突增宽、代偿性肥大等变化,继而增加肾小球滤过膜通透性并诱发蛋白尿,引起肾功能损伤。可见,维持足细胞功能与数目的稳定性是防治DN进展的有效手段。黄柏的主要活性成分为生物碱,其中盐酸小檗碱(berberine hydrochloride,BBR)含量最高。大量临床研究均证实了BBR能够有效减轻蛋白尿,延缓DN疾病进展5-7,但其对足细胞的影响尚无明确定论。本次研究观察黄柏BBR对高糖诱导下小鼠足细胞的保护作用,以期探讨其改善DN足细胞损伤的作用机制。1 材
3、料与方法1.1 细 胞小鼠肾小球足细胞,购自北纳创联生物技术研究院,BNCC 337685。1.2 药品、试剂与仪器黄柏BBR,由安徽省立医院药学实验室提供,RP-HPLC法检测纯度95%。精密称取40.365 g BBR粉末,加入生理盐水10 mL,加热至BBR完全溶解,配制成1.2104mol/L的储备液,采用0.22 m无菌过滤器过滤后分装保存,使用前溶解稀释至所需倍数。 RPMI 1640培养液,美国赛默飞世尔科技公司产品,批号11875;小鼠重组干扰素,美国派普泰克公司产品,批号315-05-100;胎牛血清,以色列生物工业公司产品,批号202005152;四甲基偶氮唑盐(MTT)粉
4、末,美国西格玛奥德里奇公司产品,批号175252;Annexin V-FITC/PI双染试剂盒,南京诺唯赞生物科技有限公司产品,批号A211-02;辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗,美国派普泰克公司产品,批号SA00001-1、SA00001-2;磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、叉头框蛋白01(FOX01)、磷酸化叉头框蛋白01(p-FOX01)单克隆抗体,美国艾博抗公司产品,批号4249、4691S、4060S、2880、9461;抗肾病蛋白(nephrin)、足突蛋白(podocin)、结蛋白(desm
5、in)、Bcl-2相互作用细胞死亡介体(Bim)蛋白多克隆抗体,美国圣克鲁斯公司产品,批号bs-1026R、sc-21009、ab-136894、sc-20235。FC500型流式细胞仪,美国贝克曼库尔特公司产品;Elx808型多功能酶标仪,美国伯腾仪器有限公司产品;BX53型倒置显微镜,日本奥林巴斯公司产品;DYY-10型电泳仪,北京六一仪器厂产品;LAS4000 mini型化学发光成像分析仪,美国通用公司产品。1.3 细胞培养将冻存的小鼠足细胞置于37 水浴复苏,RPMI 1640培养液加入100 mL/L胎牛血清、10 g/L双抗、2 g/L 干扰素,将细胞转至培养瓶内加入配制好的RPM
6、I 1640培养液,置于CO2细胞培养箱内,在37 、50 mL/L CO2条件下进行培养。隔天换液,待细胞长满75%80%时进行传代培养。在33 、50 mL/L CO2条件下进行培养,待细胞长满约30%时转入37 、50 mL/L CO2条件下进行培养,加入RPMI 1640培养液(不含干扰素)进行细胞分化,隔天换液。1014 d细胞分化成熟,可用于后续实验。1.4 检测指标1.4.1 足细胞增殖采用MTT法检测。 取指数生长期小鼠足细胞,调整细胞密度并接种于96孔板,每孔200 L(约104个细胞)。将获得的小鼠足细胞分为正常组(5.5 mmol/L葡萄糖)、模型组(30 mmol/L葡
7、萄糖)、不同浓度BBR组(30 mmol/L葡萄糖+BBR 30、60、90 mol/L)。干预24 h后,每孔加入10 L 5 g/L MTT溶液,孵育4 h,弃除上清液,每孔加入150 L DMSO,震荡10 min。采用酶标仪检测各孔490 nm处吸光值并计算细胞存活率。1.4.2 足细胞凋亡采用Annexin V-FITC/PI双染色法检测。 小鼠足细胞分组、干预方式同1.4.1,消化离心收集(15)105个细胞,悬浮于500 L 稀释5倍的结合缓冲液,加入10 L PI和5 L Annexin V-FITC溶液,混匀后室温条件下避光孵育5 min,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。1.4
8、.3 足细胞迁移能力采用Transwell小室法检测。 24孔板内放置Transwell小室,其中加入RPMI 1640培养基(含100 mL/L 胎牛血清),分别给予高糖刺激与不同浓度BBR干预,加入RPMI 1640培养基(含10 mL/L 胎牛血清)配制成单细胞悬液,并接种在Transwell小室,每孔约2104个细胞,培养箱内培养24 h。将Transwell小室取出,PBS漂洗后采用结晶紫染色,用棉签将未迁移至Transwell上室的细胞轻轻擦去,采用倒置显微镜观察小鼠足细胞迁移情况。每个样本各取5个视野计数。1.4.4 足细胞黏附作用采用细胞黏附实验检测。 足细胞传代消化后,分组及
9、干预方法同1.4.1。96孔板采用型鼠尾胶原铺板,再将足细胞种在96孔板内(每孔约1105个细胞)。大部分细胞贴壁后弃除培养液,未贴壁细胞用PBS洗去。配制枸橼酸缓冲液(2.5 g/L Triton X-100+3.75 mmol/L己糖激酶),每孔60 L加入培养孔内,37 下孵育1 h,加入甘氨酸缓冲液(含5 mmol/L依地酸二钠),每孔60 L(pH值调整为10.4),测定405 nm处吸光值,并以正常组吸光值为参考计算足细胞黏附能力。1.4.5 足细胞标志蛋白desmin、nephrin、podocin及PI3K/Akt/FOX01/Bim信号通路蛋白表达水平采用Western bl
10、ot检测。取对数生长期细胞,分组及干预方法同1.4.1。将足细胞种于6孔板(每孔1108个细胞),处理24 h后加入预冷的PBS洗涤去除杂质与死细胞,加入预冷的RIPA裂解液100 L,冰面上静置30 min。收集细胞,离心取上清液,加入蛋白上样缓冲液,沸水煮沸5 min,在SDS-PAGE凝胶上上样,完成凝胶电泳、转膜、封闭等操作;加入蛋白抗体孵育过夜,TPBS洗膜,加入一抗,放入4 冰箱内孵育过夜;次日TPBS漂洗,加入二抗,37 孵育2 h,ECL显色,进行灰度分析评估desmin、nephrin、podocin、PI3K、p-Akt、p-FOX01、Bim蛋白表达水平。1.5 统计学分
11、析2 结 果2.1 BBR对高糖损伤足细胞增殖的影响与正常组对比,模型组足细胞存活率下降,差异有统计学意义(P0.05)。与模型组对比,3个BBR组的足细胞存活率升高,差异有统计学意义(P0.05)。表明BBR可以提高足细胞存活率。见表1。表1 各组足细胞存活率对比2.2 BBR对高糖损伤足细胞凋亡的影响与正常组对比,模型组足细胞凋亡率升高,差异有统计学意义(P0.05)。与模型组对比,3个BBR组的足细胞凋亡率降低,差异有统计学意义(P0.05)。表明BBR可以降低足细胞凋亡率,且表现出浓度依赖性。见表2、图1。注:FITC和PI荧光作双参数散点图,细胞分为4个区,左上象限为机械性损伤细胞,
12、左下象限为活细胞,右上象限为凋亡晚期细胞或坏死细胞,右下象限为早期凋亡细胞。表2 各组足细胞凋亡率对比2.3 BBR对高糖损伤足细胞迁移能力的影响与正常组对比,模型组迁移至Transwell下室的足细胞数量增加,差异有统计学意义(P0.05)。与模型组对比,3个BBR组的足细胞迁移数量减少,差异有统计学意义(P0.05)。表明BBR可以减少迁移至Transwell下室足细胞数量(P0.05)。见表3、图2。图2 各组足细胞迁移能力对比(结晶紫染色,200)表3 各组足细胞迁移数量对比2.4 BBR对高糖损伤足细胞黏附作用的影响与正常组对比,模型组黏附细胞百分数降低,差异有统计学意义(P0.05
13、)。与模型组对比,3个BBR组的黏附细胞百分数升高,差异有统计学意义(P0.05)。表明BBR提高足细胞黏附能力,且呈现浓度依赖性。见表4。表4 各组足细胞黏附能力对比2.5 BBR对高糖损伤足细胞标志蛋白表达的影响与正常组对比,模型组足细胞desmin蛋白表达上调,nephrin、podocin蛋白表达下降,差异有统计学意义(P0.05)。表明BBR可以显著下调desmin蛋白表达水平,提高nephrin、podocin蛋白表达水平。见表5、图3。注:1-5依次为正常组,模型组,BBR 30、60、90 mol/L组表5 各组足细胞标志蛋白表达水平对比2.6 BBR对高糖损伤足细胞相关蛋白表
14、达水平的影响与正常组对比,模型组足细胞PI3K、p-Akt、Bim蛋白表达水平上调,p-FOX01蛋白表达水平下降,差异有统计学意义(P0.01)。与模型组对比,3个BBR组的足细胞相关蛋白表达水平均改善,差异有统计学意义(P0.05)。表明BBR可以上调p-FOX01蛋白表达水平,降低PI3K、p-Akt与Bin蛋白表达水平。见表6、图4。注:1-5依次为正常组,模型组,BBR 30、60、90 mol/L组表6 各组足细胞相关蛋白表达水平对比3 讨 论高血糖是引起足细胞损伤的重要原因之一。在高糖诱导作用下足细胞凋亡,而足细胞凋亡发生后又会通过复杂机制诱导剩余的足细胞发生凋亡,从而形成恶性循
15、环,推动DN疾病进展。郭维文等8通过研究发现:高糖环境可以诱导足细胞发生凋亡,且凋亡率随着高糖诱导时间增长而增加。可见高糖诱导足细胞凋亡是一个缓慢的病理过程,机体难以通过自我调节的方式抑制该病理过程的进展。研究证明,BBR具有良好的降糖作用,可以通过调控多元醇活化、氧化应激反应、机体血糖水平等途径减轻肾功能损伤9。郭维文等8发现BBR可以对高糖损伤的足细胞起到保护作用,有效抑制足细胞凋亡,从而延缓DN疾病进展,故推测BBR的药理作用可能与调节某种信号通路有关。高雪等10发现,芪地糖肾颗粒可以抑制细胞外调节蛋白激酶信号通路,从而降低大鼠尿白蛋白水平,减轻DN足细胞损伤。曹璐璐等11研究发现,疏利三焦法可以抑制转化生长因子-(TGF-)/Smad信号通路激活,起到抑制足细胞凋亡、延缓DN疾病进展的作用。可见,各种信号通路诱导足细胞凋亡是导致DN进展的主要原因。本研究发现,高糖刺激下,小鼠足细胞PI3K、p-Akt、Bim蛋白表达水平上调(P0.05),p-FOX01蛋白表达水平下降(P素问脏气法时论篇云:“肾欲坚,急食苦以坚之。”珍珠囊云:“苦能燥,能坚。”故而衍生出“苦能坚阴”之说。其含义为苦寒药物可以通过泻火起到存阴的作用,其中“坚阴”指“坚肾阴”18-19。得配本草曰:“以黄柏补水,以其能清自下泛上之阴火不妨用苦寒者除之。”历代医家都认为:黄柏等
