《细胞周期蛋白K促进食管鳞癌细胞增殖的机制研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞周期蛋白K促进食管鳞癌细胞增殖的机制研究（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 细胞周期蛋白K促进食管鳞癌细胞增殖的机制研究* 尚瑶， 王芳， 王歆慧， 孔鹏洲， 成晓龙 论著 细胞周期蛋白K促进食管鳞癌细胞增殖的机制研究*尚瑶1，2， 王芳2， 王歆慧1，2， 孔鹏洲2， 成晓龙2（1山西医科大学基础医学院，山西 太原 030001；2山西医科大学医学转化研究中心，山西 太原 030001）探讨细胞周期蛋白K（CCNK）促进食管鳞状细胞癌（ESCC）发生发展的机制。对中国ESCC高发区155例患者的转录组数据及GSE53625数据库进行基因差异表达分析；通过转染慢病毒分别在KYSE150、KYSE30及KYSE180细胞中构建基因稳定敲减（CCNK-SH）和阴性对照（
2、NC）细胞株；利用集落形成实验和CCK-8法检测敲减基因对ESCC细胞增殖的影响；应用流式细胞术检测敲减基因对ESCC细胞周期的影响；分析155例ESCC患者转录组数据，对差异表达基因进行信号通路富集；应用免疫荧光染色检测DNA损伤的指标-H2AX；分析155例ESCC患者转录组数据和RT-qPCR实验验证基因与DNA损伤修复相关基因表达的情况。基因在ESCC组织中高表达（0.01）；与NC组相比，CCNK-SH组细胞增殖和集落形成能力显著降低（0.01）；免疫荧光染色结果显示，与NC组相比，CCNK-SH组-H2AX信号显著增强（0.01）；基因表达与DNA损伤相关基因存在显著相关性。CCN
3、K可能通过DNA损伤修复机制参与细胞周期调控，从而影响ESCC细胞的增殖。食管鳞状细胞癌；细胞周期蛋白K；细胞增殖；细胞周期；DNA损伤食管癌是世界上最致命的癌症之一，其发病率和死亡率在中国位居前十1，癌变过程与癌基因的异常激活和抑癌基因的异常失活密切相关2。食管腺癌和食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma， ESCC）是食道恶性肿瘤的两种主要亚型，各自具有不同的流行病学和病理生理学特征3。在中国，ESCC是食管癌的主要亚型，流行率很高，特别是在北部的太行山脉地区，一经检测多为晚期，病死率高，预后差，5年生存率不足20%4-6。因此，寻找新靶点对早
4、期诊断和治疗ESCC具有重要意义。DNA是遗传的基本单位，是遗传信息的来源7-8。人体中的1013个细胞中每个细胞每天都会受到数万个DNA损伤，这些损伤会阻止基因组复制和转录9。DNA损伤通常由固有的DNA损伤反应机制识别和修复，如果受损的细胞被成功修复，细胞就会存活10。细胞周期中的细胞进程由细胞周期蛋白依赖的激酶调节，以避免在前一个细胞周期完成之前启动一个细胞周期。DNA损伤会干扰细胞周期，因此，有一些检查点蛋白可以延缓细胞周期进程，为DNA修复提供必要的时间11。细胞周期蛋白K（cyclin K， CCNK）是一种有580个氨基酸残基的蛋白质，通过其调节RNA聚合酶II大亚基的C端结构域
5、磷酸化的作用，参与转录控制12。有研究表明，CCNK调节前复合体组装的形成且CCNK的表达与细胞增殖呈正相关13。细胞周期蛋白依赖性激酶已经发展成为治疗多种疾病（包括癌症和白血病）的重要靶蛋白14。然而，基因在ESCC中的生理作用仍不清楚。本研究旨在通过一系列的实验，探讨基因在ESCC中的作用机制，为后续进一步研究提供参考资料。材料和方法1细胞系本研究所用到的ESCC细胞株TE1、KYSE150、KYSE140、KYSE180、KYSE410、KYSE450、KYSE30、KYSE510、KYSE680和KYSE70来自中国科学院上海生命科学研究细胞资源中心，由山西医科大学转化医学中心食管癌发
6、病机理及转化研究中心样本库保存。2主要试剂及仪器细胞培养液和胰蛋白酶购自HyClone；胎牛血清购自Gibco；Trizol、RNA反转录试剂盒和RT-qPCR试剂盒均购自TaKaRa；Western blotting检测所需试剂购自Solarbio；细胞增殖及毒性检测试剂盒（CCK-8，MA0218）购自大连博格林生物科技有限公司；DNA损伤检测试剂盒（C2035S）购自上海碧云天生物技术有限公司；盐酸博来霉素购于MedChemExpress。普通PCR仪（Veriti）和荧光定量PCR仪（StepOne Plus）均购自Applied Biosystems；蛋白电泳系统和蛋白转印系统均购自
7、Bio-Rad；低温高速离心机（Micro21R）和CO2恒温细胞培养箱均购自Thermo。3研究对象本课题所用155例ESCC组织和配对的癌旁组织均收集自中国食管癌高发区山西省肿瘤医院，第一次进行手术切除治疗，术前未经过新辅助疗法、化疗或放疗。ESCC的临床分级参照美国癌症联合委员会及国际抗癌联盟指定的2010年第7版TNM分级标准。所有标本的采集均通过了患者本人及家属同意并签署了知情同意书，已取得山西省肿瘤医院伦理委员会及山西医科大学伦理委员会同意。具体信息见表1。表1155例样本临床信息4实验方法4.1ESCC细胞培养与分组KYSE30、KYSE150和KYSE180细胞均以含10%胎牛
8、血清和1%双抗（青霉素和链霉素混合溶液）的RPMI-1640培养液，置于37 、5% CO2的培养箱中培养。细胞密度达到70%80%进行传代培养，每23 d换一次液。在KYSE30、KYSE150和KYSE180细胞中转染CCNK-shRNA病毒，之后将细胞分为对照组（KYSE30、KYSE150和KYSE180组）和敲减组（KYSE30-CCNK-SH、KYSE150-CCNK-SH和KYSE180-CCNK-SH组）共6组细胞，进行后续实验。4.2基因稳定敲减细胞株的构建由于基因在ESCC中表达量很高，因此我们选择了三种ESCC细胞系进行敲减。根据细胞本身的特性及状态，我们筛选出KYSE3
9、0、KYSE180和KYSE150细胞系用于构建稳定敲减基因的细胞株。感染慢病毒前1 d将细胞接种至24孔板中，每孔1104个细胞，次日感染CCNK-shRNA病毒，弃掉孔板中原有培养液，根据MOI=10、50和100计算病毒体积，用无双抗的完全培养液将液体补至250 L，放入细胞培养箱中培养6 h后补液至500 L，待细胞密度达到50%后加嘌呤霉素筛选12周。4.3RT-qPCR使用Trizol法提取总RNA，利用PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒（RR036A； TaKaRa）进行反转录，反应条件为：37 15 min85 5 s4 保存。利用TB GreenPre
10、mix Ex TaqTM试剂盒（RR420Q； TaKaRa）进行RT-qPCR，根据说明书配制体系后按照以下条件进行：95 510 min（95 15 s65 15 s72 3060 s）3040个循环4 保存。最后用2-Ct法计算相对表达量。引物序列见表2。表2RT-qPCR引物序列4.4Western blot将收集的细胞沉淀在含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液中裂解。4 、12 000离心30 min后收集上清液。用BCA法测定蛋白质浓度。配制ESCC细胞蛋白样品，进行SDS-PAGE凝胶电泳，转至PVDF膜上；用5%脱脂奶粉在室温下封闭1 h，之后加入抗GAPDH抗体（60004-1-Ig；
11、 Proteintech）或抗CCNK抗体（AB85854； Abcam）于4 孵育过夜；次日用TBST洗涤3次，之后加入荧光标记的羊抗兔IgG（926-32211； LI-COR）或羊抗小鼠IgG（926-32210； LI-COR），室温孵育2 h，用TBST洗膜后上机检测蛋白条带并使用ImageJ软件进行分析。4.5CCK-8实验将CCNK-SH组和对照组细胞接种于96孔板中，每孔3103个细胞（重悬于200 L培养液中），分别于24、48、72和96 h加入100 L含10% CCK-8试剂的培养液，加入前注意将原培养液吸尽，于培养箱内培养0.54 h后，用酶标仪检测在450 nm处吸
12、光度，分析数据并绘制图表。4.6集落形成实验将CCNK-SH组和对照组细胞接种于6孔板中（每孔500个细胞），置于37 的培养箱中培养，每隔3 d观察一次。1014 d后，将形成集落的细胞用4%的多聚甲醛固定，并用结晶紫染色，于镜下观察并拍照，计数统计并绘制图表。4.7流式细胞术收集对数生长期的CCNK-SH组和对照组细胞，消化离心后弃上清，用PBS洗2次，之后用预冷的70%乙醇固定24 h， 300离心3 min，弃上清，用PBS洗一遍，之后加入由450 L PI和50 L RNase A配成的混合液于室温避光0.51 h，之后按照流式细胞仪操作方法检测细胞周期分布，分析数据并绘制图表。4.
13、8盐酸博来霉素溶液配制盐酸博来霉素分子量为1 451 g/mol。母液配制：用无菌去离子水溶解配成10 g/L（6.892 mmol/L），分装成每管200 L，-80 密封避光储存。稀释液配制：10 mL完全培养液中加1.45 L盐酸博来霉素母液，配成1 mol/L稀释液10 mL，再分别配成10、20、50、100和200 mol/L的稀释液。通过前期摸索及文献查找，观察到当盐酸博来霉素浓度为50 mol/L、诱导2 h时效果最好。4.9DNA损伤检测将CCNK-SH组和对照组细胞接种至6孔板中，待细胞贴壁后于细胞中加入50 mol/L盐酸博来霉素诱导DNA损伤2 h，之后根据DNA损伤检
14、测试剂盒说明书进行操作。首先吸除培养液，用PBS洗涤1次；随后加入1 mL固定液，固定515 min，用洗涤液洗3次，每次5 min；之后加入1 mL免疫染色封闭液，常温封闭1020 min，去除封闭液，加入1 mL -H2AX兔单抗，4 过夜；洗涤液洗3次后加入1 mL抗兔Alexa Fluor 594室温孵育1 h，之后加入1 mL DAPI染色液，常温放置5 min左右进行核染色；最后在细胞表面加入一定量抗荧光淬灭封片液，盖上盖玻片，进行封片。在荧光显微镜下观察染色情况。5统计学分析本研究的所有实验数据均进行了3次独立重复实验。使用GraphPad Prism 8作图并进行数据处理。结果
15、表示为均数标准差（meanSD）。采用检验或方差分析进行组间差异分析，以0.2或-0.2认为存在相关性。结果1CCNK在ESCC中高表达通过分析155例ESCC患者的转录组数据，提示CCNK mRNA在ESCC肿瘤组织中的平均表达量是29.879 4，在正常组织的平均表达量是21.740 7，肿瘤组织中的表达是正常组织的1.37倍（0.01），见图1B。Figure 1.The mRNA expression of CCNK in transcriptome data from esophageal squamous cell carcinoma patients （A； n=155） and GSE53625 database （B； n=358）. The mRNA levels of CCNK in ESCC tumor tissues （T） and corresponding non-tumor tissues （N） were analyzed using paired t-test （P0.01）.2CCNK基因敲减稳株的效率检测RT-qPCR检测CCNK在各个ESCC细胞系中的mRNA表达，结果见图2。Figure 2.The mRNA expression of CCNK in different esophageal squamous cell car
