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1、 发芽绿豆多酚提取物对型糖尿病小鼠糖脂代谢的改善作用 沈鑫婷，姜秀杰，许庆鹏，张东杰*（1 黑龙江省农业科学院食品加工研究所 黑龙江省食品加工重点实验室黑龙江省全谷物营养食品工程技术研究中心 哈尔滨 150086 2 黑龙江八一农垦大学 黑龙江大庆 163000）2 型糖尿病通常被称为非胰岛素依赖型糖尿病，是一种以持续高血糖诊断为基础的代谢性疾病1。对于糖尿病的治疗可以防止一些破坏性的并发症，然而，通常不能恢复到正常血糖或消除所带来的不良后果2。其特点是由慢性高血糖驱动的胰岛素抵抗，通常通过血糖诊断3。它与基因或一些生活方式相关，到目前为止肥胖是最常见的风险因素4。根据世界卫生组织（WHO20
2、16 年）的数据，2 型糖尿病占病例的90%95%，而且几十年来的迅速增长一直是一个国际问题5。目前治疗糖尿病的常用降糖药物虽具有较好的效果，但大多具有副作用6。开发一种天然安全的药物成为当前研究糖尿病的重点，而来源于食品或植物中的天然活性成分因安全、健康、作用效果温和的特点而备受青睐。豆科植物被认为是第二重要的人类粮食作物，仅次于谷物（禾本科豆科），因为与谷物相比，它们营养丰富、均衡，被称为“穷人的肉”7-8。绿豆，又名青小豆、菉豆、植豆等，在所有类型的豆类植物中，绿豆的营养价值较高9-10。有研究表明绿豆及其提取物具有许多其它潜在的健康益处，如降血糖、降血脂作用以及抗高血压、抗癌、抗黑素生
3、成、保护肝脏和免疫调节特性11-16。本研究利用黑龙江省特色绿豆资源作为多酚富集原料。与绿豆17-19相比，萌发和发酵的绿豆及其提取物具有更好的肝保护作用，而且发芽后绿豆的抗氧化活性也有所提高。发芽处理作为加工手段之一，可有效提高谷物的营养价值和生物活性成分含量，相比之下，当绿豆经发芽处理后，许多的大分子物质会降解成为各种小分子物质，更加利于人体的吸收，发芽绿豆比未发芽的绿豆含有更多的功能性物质20，其中的酚酸和类黄酮（包括牡荆素和异牡荆素）的总含量显著增加，分别是生绿豆种子的4.5倍和6.8 倍21-22。酚类物质是人类日常饮食中最重要的抗氧化剂23，具有降血糖、降血压等作用。发芽绿豆多酚是
4、以绿豆为原料，经发芽处理后，采用超声辅助乙醇提取法得到的具有生物活性的物质，本试验前期已证明发芽绿豆多酚提取物对-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，并表现出较好的体外降糖效果。而发芽绿豆多酚在小鼠体内的降血糖效果以及对肝脏组织形态的影响未做深入研究。本试验建立2 型糖尿病小鼠模型，对造模成功小鼠灌胃不同浓度的发芽绿豆多酚提取物，观察其调控血糖的效果，并通过与T2DM 模型组小鼠空腹血糖、血脂水平、葡萄糖耐受量以及肝脏组织切片情况的对比，探究发芽绿豆多酚提取物对T2DM 小鼠降血糖的影响。1 材料与方法1.1 动物、材料与试剂C57BL/6 小鼠（1820）g，SPF 级，雄性，购于辽宁长生生物技术股
5、份有限公司（许可证号：SCXK（辽）2020-0001）本实验动物处理遵循黑龙江八一农垦大学动物伦理委员会原则。基础饲料、高脂饲料，购于南通特洛菲饲料科技有限公司。发芽绿豆多酚，黑龙江八一农垦大学食品学院实验室制备；链脲佐菌素、盐酸二甲双胍，上海源叶生物科技有限公司；试剂盒，南京建成生物技术有限公司；其它试剂均为分析纯。1.2 仪器与设备GA-3 血糖仪，三诺生物传感股份有限公司；TU-1810 紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；酶标仪，中国迈瑞医疗公司；RE-2000A 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。1.3 方法1.3.1 发芽绿豆多酚的制备流程 发芽绿豆多酚制备24-27：
6、将绿豆进行发芽处理（采用响应面优化法，确定绿豆的最优发芽工艺为：绿豆的浸泡温度25 、浸泡时间11 h、发芽温度28 、发芽时间3 d、浸泡液CaCl2浓度2 mmol/L）烘干粉碎过筛醇提发芽绿豆多酚粗提物浓缩冷冻干燥AB-8 大孔树脂纯化冷冻干燥制得发芽绿豆多酚。1.3.2 2 型糖尿病模型的建立 SPF 级C57BL/6雄性小鼠在12 h 明暗交替（8：00-20：00），室温（232），相对湿度40%左右且通风良好的环境下分笼饲养，试验期间自由饮食饮水。适应性喂养1 周，根据体重随机分为正常对照组（n=6）和造模组（n=30），正常组和造模组分别进食基础饲料和高脂饲料，共4 周，禁食1
7、2 h，造模组小鼠腹腔注射30 mg/kgBW STZ，正常组注射相同体积柠檬酸缓冲液（pH=4）28-29。3 d 后测定小鼠空腹血糖值，在造模后第7 天检测空腹血糖水平超过11.1 mmol/L 且伴随表现出“三多一少”特征的小鼠被视为造模成功。1.3.3 动物分组及给药方法 将造模成功的小鼠随机分为5 组：模型组（DM）、阳性对照组（MET，二甲双胍，150 mg/kg）、高剂量组（150 mg/kg）、中剂量组（100 mg/kg）、低剂量组（50 mg/kg）。阳性对照组以及低、中、高剂量治疗组分别用二甲双胍水溶液和发芽绿豆多酚水溶液进行灌胃，其它组灌胃等体积生理盐水，连续灌胃5 周
8、。试验期间，每天观察动物进食量、精神状态、毛发色泽等，每周按时称量小鼠体重。1.3.4 空腹血糖值测定及口服葡萄糖耐受试验每周按时禁食12 h，测定空腹血糖值。在末次给药后，小鼠禁食不禁水6 h，以2 g/kg bw 剂量灌胃25%的葡萄糖溶液，测定灌胃第0，30，60，90，120 min 的血糖值，根据公式（1）计算血糖曲线下面积（AUC），通过曲线下面积来表达葡萄糖耐受量（OGTT）的变化。1.3.5 小鼠脏器指数的测定 解剖后，摘取小鼠肝脏、肾脏、胰腺等组织，用生理盐水冲洗组织，用滤纸吸干水分，称重，并根据公式（2）计算脏器指数。1.3.6 血清指标测定 试验结束时，小鼠禁食12 h，
9、乙醚麻醉，摘眼球取血，室温下静置30 min，低温3 500 r/min 离心10 min，取血清，备用。1.3.7 肝脏组织病理学观察 取部分固定于4%多聚甲醛溶液中的新鲜肝脏组织，将其石蜡包埋、切片、染色、封片处理，于电子显微镜下进行病理学形态观察。1.4 数据统计分析用SPSS 进行数据处理，结果以平均值标准差表示，用ANOVA 及多重比较进行显著性差异分析，P0.05 为差异显著，P0.01 为差异极显著。用Origin 软件作图。2 结果与分析2.1 小鼠一般状况及体重变化试验期间，观察发现正常组小鼠精神状态良好，毛发光滑，试验前后的进食量、饮水量比较稳定，体重逐渐增长。糖尿病模型组
10、小鼠精神比较萎靡，毛发暗淡无光泽，与试验前对比出现了“三多一少”症状。阳性对照组和各剂量干预组的小鼠体重下降趋势减缓，精神状态也有所好转。如表1 所示，造模成功后，模型组小鼠体重和正常组小鼠相比，出现极显著下降（P0.01）；试验结束时，与模型组对比，灌胃发芽绿豆多酚溶液中剂量组小鼠体重显著增加（P0.05），高剂量组和灌胃二甲双胍的阳性对照组小鼠体重极显著增加（P0.01）。表1 发芽绿豆多酚对小鼠体重的影响（，n=6）Table 1 Effect of germinated mung bean polyphenols on body weight of mice（，n=6）表1 发芽绿豆多
11、酚对小鼠体重的影响（，n=6）Table 1 Effect of germinated mung bean polyphenols on body weight of mice（，n=6）注：# 表示模型组与正常组比较差异极显著（P0.01）；* 表示各组与模型组比较差异显著（P0.05）；* 表示各组与模型组比较差异极显著（P0.01），下同。2.2 发芽绿豆多酚对小鼠脏器指数的影响通过脏器指数可以看出实验动物的状态以及病变情况。由表2 显示，与正常对照组相比，模型组小鼠的肝脏指数显著升高了49.26%（P0.01）；与模型组比较，中、高剂量组和阳性对照组的肝脏指数均显著降低（P0.05，P
12、0.01）。表明糖尿病小鼠会出现明显的肝脏、肾脏肿胀现象，而二甲双胍阳性药物和各剂量组治疗后会在一定程度上减轻脏器肿胀；也表明发芽绿豆多酚具有改善型糖尿病小鼠脏器指数的作用。表2 发芽绿豆多酚对小鼠脏器指数的影响（n=6）Table 2 Effect of germinated mung bean polyphenols on organ index of mice（n=6）2.3 发芽绿豆多酚对小鼠空腹血糖及糖耐量的影响由表3 可知，正常组小鼠空腹血糖浓度比较稳定，模型组小鼠的空腹血糖浓度在造模成功后呈现逐渐上升趋势；与模型组相比，在治疗第4 周时，中、高剂量组空腹血糖均极显著低于模型组；在
13、试验结束时，低、中、高剂量组的空腹血糖浓度表现出极显著低于模型组（P0.01）。空腹血糖的测定结果表明发芽绿豆多酚溶液可以改善型糖尿病小鼠干预期间的血糖水平，治疗组中以高剂量组的多酚溶液效果最佳。表3 发芽绿豆多酚对小鼠血糖的影响（，n=6）Table 3 Effect of germinated mung bean polyphenols on blood glucose in mice（，n=6）表3 发芽绿豆多酚对小鼠血糖的影响（，n=6）Table 3 Effect of germinated mung bean polyphenols on blood glucose in mice
14、（，n=6）糖耐量是指对葡萄糖的耐受能力，可以根据机体耐受葡萄糖的程度来判断给药后胰岛 细胞对血糖的调节能力。血糖曲线下面积可以用来表示人体利用和清除葡萄糖的程度，如果数值增大，说明机体糖耐量能力下降，反之则能力升高。如表4 所示，正常组小鼠的血糖浓度随着时间变化趋势平缓，而模型组小鼠血糖在前30 min 快速升高，并达到峰值后又呈现下降趋势，但血糖值一直较高。各剂量治疗组的血糖值在60 min 后缓慢下降，但均未恢复到初始血糖值。由表4 可知，模型组的AUC 显著高于正常组（P0.01），各剂量治疗组和阳性对照组与模型组比呈现显著性降低（P0.01）。结果表明，发芽绿豆多酚溶液可以在一定程度
15、上提高型糖尿病小鼠的糖耐量，且从恢复程度上看，高剂量效果较好。表4 发芽绿豆多酚对小鼠糖耐量的影响Table 4 Effects of germinated mung bean polyphenols on glucose tolerance in mice2.4 发芽绿豆多酚对小鼠血清含量的影响糖尿病与血脂水平密切相关，降低血脂水平会有助于改善糖尿病。由图1 可知，与正常组相比，模型组小鼠的TC、TG、LDL-C 浓度均极显著升高，HDL-C 浓度下降，这表明糖尿病小鼠已经出现了脂代谢紊乱的情况。与模型组对比，阳性对照组和低、中、高剂量组的TC 浓度分别降低了36.07%，16.86%，24
16、.31%，27.84%（P0.01），LDL-C浓度也呈现显著的下降趋势，阳性对照组和中剂量组的TG 浓度也分别降低了25.17%，20.49%（P0.05），说明发芽绿豆多酚提取物对T2DM 小鼠脂代谢紊乱有较好的调节作用。图1 发芽绿豆多酚对小鼠血脂的影响Fig.1 Effect of germinated mung bean polyphenols on blood lipid in mice2.5 发芽绿豆多酚对小鼠肝损伤的影响ALT 和AST 酶活力的高低，是反映肝脏组织功能的一项重要指标，而通过肝脏病理能够更直观的判断组织的受损情况。由图2 可知，模型组小鼠的ALT 活力与正常组比增加了86.40%，AST 活力增加了8
