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1、 结核分枝杆菌Rv2333c在巨噬细胞内功能的初步研究 何萍 王怡婷 宋泽萱 夏辉 王胜芬 贺文从 郑扬 赵雁林结核病依旧是全球公共卫生需要攻克的难关,临床上越来越多的耐多药结核分枝杆菌的出现更加剧了这一严峻形势1。一方面,耐药性的产生多与其自身药物转运泵相关,在结核分枝杆菌主要的耐药泵包括主要异化超家族(major facilitator superfamily,MFS)、耐受-生节-分裂家族(resistance-nodulation-division family,RND)、三磷酸腺苷结合转运蛋白家族(ATP-binding cassette transporter family,ABC
2、)和小多重耐药家族(small multidrug resistance family,SMR)2中,MFS家族多为跨膜转运蛋白,拥有多个跨膜区,在细菌感染机体中发挥重要作用3。结核分枝杆菌感染机体时,往往最先与肺部巨噬细胞接触,使得机体巨噬细胞多在清除结核分枝杆菌早期感染过程中即发挥重要作用。另一方面,结核分枝杆菌侵染机体会引起细胞免疫,而结核分枝杆菌通过改变细胞内一系列信号通路的变化如肿瘤坏死因子(TNF-)、核因子激活B细胞的-轻链增强(NF-B)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径等来阻断机体对自身的清除杀伤作用4。已有研究表明,结核分枝杆菌可通过参与NF-B和MAPK途径与巨噬细
3、胞产生相互作用,但其分子机制尚不清楚。结核分枝杆菌Rv2333c属于MFS家族,参与结核分枝杆菌对壮观霉素和四环素的先天性耐药5,但其具体的耐药机制和免疫功能也并不很清楚。本研究通过在耻垢分枝杆菌内表达Rv2333c基因,构建耻垢分枝杆菌过表达Rv2333c菌株,进而用其感染小鼠巨噬细胞J774A.1,探究Rv2333c与NF-B途径的关系,即Rv2333c在细菌感染巨噬细胞过程中所发挥的功能。材料和方法一、研究材料1.菌株：耻垢分枝杆菌mc2155(ATCC700084)和结核分枝杆菌H37Rv(ATCC27294)均由中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心结核病国家参比实验室保存。小鼠巨噬
4、细胞J774A.1采购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。质粒pSUM-Kan-MCS2购自全球质粒共享信息库(Addgene;plasmid#109289)。2.试剂与仪器：KOD plus Neo(PCR试剂盒),东洋纺(上海)生物科技有限公司;2Taq Master Mix,江苏康为世纪生物科技有限公司;LB琼脂和LB肉汤,北京陆桥技术有限公司;Middle brook 7H9和Middle brook 7H10,美国碧迪医疗器械有限公司;高糖培养基DMEM、胎牛血清(FBS)和磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4),美国赛默飞世尔科技公司;anti-HA抗体和anti-Rabbi
5、t抗体,美国Cell Signaling Technology公司;化学发光试剂盒,美国赛默飞世尔科技公司;Mouse IL-1 bate/IL-1F2 Duo Set酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒,美国Bio-Techne Corporation公司;酶标仪、电转仪和蛋白印迹转膜槽,美国伯乐生命医学产品有限公司;触摸屏二氧化碳培养箱,德国美墨尔特贸易有限公司。二、研究方法1.重组质粒的构建：根据美国国家生物信息中心(NCBI)上公布的结核分枝杆菌Rv2333c基因序列(1627 bp)设计、合成引物并进行目的基因序列的扩增,扩增C段添加HA标签序列。上游引物Rv2333c-fwd：5-
6、CCAAGCTTTCATGAACCGCACACAGCTCCT-3,下游引物Rv2333c-HA-rev：5-CCAAGCTTTCAGGCGTAGTCCGGCACGTCGTACGGGTAGGCAGGCCATAGTCGACACCA-3。将Rv2333c的PCR扩增产物取5 l进行核酸电泳跑胶,若琼脂糖凝胶上出现约1627 bp的条带,说明Rv2333c片段扩增成功。使用限制性内切酶Hind 分别处理Rv2333c基因扩增片段和质粒pSUM-Kan-MCS2,37 处理2 h后纯化回收。使用T4连接酶16 处理2 h后,混合产物热激转入E.coliDH5感受态细胞,涂布于含有卡那霉素(50 g/ml
7、)的LB琼脂板,37 过夜培养。通过使用Rv2333c基因的验证引物进行菌落聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),以筛选阳性克隆并进行测序分析。将菌落PCR扩增产物取5 l进行核酸电泳跑胶,若琼脂糖凝胶上出现约1627 bp的条带,说明该克隆内含有Rv2333c片段,将此克隆提取质粒进行测序检测。重组质粒pSUM-MCS2-Rv2333c构建成功后,通过电转化方法转入耻垢分枝杆菌mc2155感受态细胞内,转化产物涂布于含有卡那霉素(50 g/ml)和0.05% Tween-80的Middle brook 7H10琼脂板,37 培养35 d。2.Rv233
8、3c在耻垢分枝杆菌中的表达：将含有重组质粒pSUM-MCS2-Rv2333c和空载pSUM-Kan-MCS2的耻垢分枝杆菌(Ms_Rv2333c和Ms_Vec)培养于含有卡那霉素(50 g/ml)和0.05% Tween-80的10 ml Middle brook 7H9液体培养基中,37 培养24 h,4000g离心30 min收集菌体。用1 ml 1PBS重悬菌体,加入0.1 mm硅珠振荡破碎,12 000g离心10 min收集菌体蛋白。样品中加入4蛋白上样缓冲液 (4protein loading buffer),煮沸处理10 min后,加样于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-P
9、AGE),并通过anti-HA抗体进行蛋白免疫印迹实验(Western blotting实验)。若在PVDF膜的Ms_Rv2333c样品泳道内出现相对分子质量大约为58 200的条带,而Ms_Vec样品泳道内没有出现,则说明Rv2333c在耻垢分枝杆菌内正常表达。3.重组耻垢分枝杆菌生长曲线的测定：将Ms_Vec 和Ms_Rv2333c转接于300 ml 7H9液体培养基内,调整初始吸光度值(A600)为0.01,37 、摇床培养箱转速设定为180 转/min,培养48 h。每隔6 h测量1次A600值,记录数据并绘制生长曲线。4.Rv2333c过表达菌株对巨噬细胞毒性影响分析：将小鼠巨噬细胞
10、J774A.1以5103/孔接种于96孔细胞培养板上,每组设置3个平行复孔,使用含有10% FBS的高糖DMEM培养基于37 、5%CO2细胞培养箱内过夜培养。将重组耻垢分枝杆菌(Ms_Rv2333c;实验组)和空载耻垢分枝杆菌(Ms_Vec;空载组)按照感染量MOI=101加入细胞孔中,感染6、24和48 h后,按照乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒说明书处理样品,检测每个时间段巨噬细胞的活性。注 泳道M为DNA分子质量标准;图1中泳道1为Rv2333c PCR扩增产物;图2中17泳道均为重组质粒PCR扩增片段,8泳道为阴性对照;1627 bp为Rv2333c序列的碱基对数目图12 Rv
11、2333c重组质粒的构建5.Rv2333c过表达菌株在巨噬细胞内存活能力的影响：将小鼠巨噬细胞J774A.1以5105/孔接种于12孔细胞培养板中,使用含有10% FBS的高糖DMEM培养基于37 、5%CO2细胞培养箱内过夜培养。将Ms_Rv2333c和Ms_Vec按照感染量MOI=101加入细胞孔中,感染2 h后弃掉细胞培养液,并用1PBS反复清洗每个细胞孔3遍。之后每个细胞孔内加入1 ml含有200 g/ml的庆大霉素和10% FBS的高糖DMEM培养基。在此后的6、24和48 h时使用1%曲拉通100裂解细胞。将裂解样品倍比稀释,每个稀释浓度取10 l接种到含有卡那霉素(50 g/ml
12、)和0.05% Tween-80的Middle brook 7H10固体培养皿中,每个梯度样品做3个平行。将培养皿置于37 培养23 d。统计培养皿上的菌落个数,进行重组耻垢分枝杆菌巨噬细胞胞内存活实验。6.RT-PCR和ELISA检测：将小鼠巨噬细胞J774A.1以5105/孔接种于12孔细胞培养板中,过夜培养,Ms_Rv2333c和Ms_Vec按照感染量MOI=101加入细胞孔中。于6、24和48 h后收集上清培养液,同时用裂解液裂解收集细胞样品。按照细胞RNA提取试剂盒说明书提取裂解细胞样品RNA,并进行反转录反应和荧光定量PCR检测。上清培养液按照ELISA试剂盒处理,检测细胞因子蛋白
13、水平的变化。7.Western blotting检测：将小鼠巨噬细胞J774A.1以5105/孔接种于12孔细胞培养板中,过夜培养,Ms_Rv2333c和Ms_Vec按照感染量MOI=101加入细胞孔中。感染3、6、12和24 h后用裂解液裂解收集细胞样品,进行NF-B、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)检测。三、统计学处理结 果一、Rv2333c重组质粒构建利用特异引物扩增Rv2333c片段,琼脂糖凝胶电泳结果显示得到大小符合预期的扩增产物(图1),然后将目的条带处PCR产物割胶回收并纯化,进行后续实验。菌落PCR显示3个克隆有明显的目的
14、条带(图2),提取质粒进行测序检测,结果显示序列与Rv2333c片段序列一致,说明重组质粒构建成功。二、Rv2333c在耻垢分枝杆菌中的表达将Ms_Vec和Ms_Rv2333c挑取单克隆接种于液体培养基,收集细菌蛋白做Western blotting检测。结果显示,在重组耻垢分枝杆菌内,Rv2333c在相对分子质量为58 200处有特异性条带(图3),说明Rv2333c在耻垢分枝杆菌内正常表达。注 Ms_Rv2333c：重组耻垢分枝杆菌(实验组);Ms_Vec：空载耻垢分枝杆菌。HA：检测抗体图3 Rv2333c在耻垢分枝杆菌内表达三、Rv2333c表达对耻垢分枝杆菌生长无影响为探究Rv233
15、3c表达时是否影响耻垢分枝杆菌的生长,研究完成了重组耻垢分枝杆菌生长曲线的测定,并将生长曲线根据生长速率划分为生长前期(012 h)、中期(1842 h)和后期(48 h)3个时间段。结果显示,Rv2333c的表达对耻垢分枝杆菌生长无影响,Ms_Rv2333c和Ms_Vec不论在细菌生长前期、中期还是后期差异均无统计学意义(表1和图4)。四、Rv2333c在感染初期抑制巨噬细胞调亡为了更进一步探究Rv2333c是否对巨噬细胞调亡有影响。Ms_Rv2333c和Ms_Vec以感染量MOI=101感染巨噬细胞,在6、24和48 h后检测细胞活性。结果显示,相较于Ms_Vec,Ms_Rv2333c在6
16、 h时LDH释放量明显下调,对巨噬细胞的细胞毒性降低(表2和图5)。表1 Ms_Vec和Ms_Rv2333c体外生长速率比较注 Ms_Rv2333c：重组耻垢分枝杆菌(实验组);Ms_Vec：空载耻垢分枝杆菌图4 重组耻垢分枝杆菌生长曲线测定表2 Ms_Vec和Ms_Rv2333c对细胞毒性的影响注 Ms_Rv2333c：重组耻垢分枝杆菌(实验组);Ms_Vec：空载耻垢分枝杆菌。 *为P五、Rv2333c对耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内存活能力的影响为进一步探究Rv2333c抑制巨噬细胞调亡是否由细菌在细胞内复制繁殖引起,笔者进行了巨噬细胞内菌落计数实验。Ms_Rv2333c和Ms_Vec以感染量MOI=101感染巨噬细胞,6、24和48 h后裂解细胞,然后将含菌裂
