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1、 动物实验替代技术在化妆品研究与评价中的应用与挑战 岳芸芸 尚靖Key：替代技术；化妆品；毒理学检验；功效评价随着全球生命科学和信息技术的高速发展，动物实验替代技术作为实验动物学和毒理学学科的重要分支得到了快速发展，其应用涵盖了生物医药、化工和环境科学等多个领域。从1959 年“3R”原则提出，60 年来，全球动物实验替代技术的发展经历了起步和累积阶段（1959 1990 年）和法规接受阶段（1991 2012 年），目前已进入快速发展阶段（2013 2023 年）。自2013 年起，欧盟宣布全面禁止对化妆品成分进行动物测试，并禁止销售经动物测试的化妆品和化妆品原料，截至目前，全球已经有30
2、多个国家和地区实施了关于化妆品动物实验的禁令。受国际实验动物福利及“3R”原则的影响，我国科技部于1997 年在“九五”和“十五”计划期间将实验动物替代研究列入实验动物基础性研究的重点内容，明确指出动物实验应遵循“3R”原则。并且自2014 年起，首次免除国产非特殊用途化妆品的强制性动物实验要求，近20 多年来我国有序稳步地推进化妆品替代实验的发展。目前，相关技术主要用于毒理学检测和安全评估方面。本文对国内外动物实验替代的发展历程与新替代技术进行了综述，为我国化妆品的国际化发展提供借鉴。20 世纪初，全球范围内多起严重的药品安全事故推动了动物实验在新药开发过程中应用于毒理和安全性测试。1938
3、 年，FDA 颁布的联邦食品药品及化妆品法案要求化妆品提供确保安全性的证明，实施“动物试验强制令”。毫无疑问，动物试验为人类健康作出了重要贡献。从概念及内涵上看，动物实验是以实验动物为材料，采用各种方法在实验动物身上进行的科学实验研究，但实验周期长、花费大，且由于种属差异等使实验结果在预测人体毒性风险时存在着不确定性1-3。1959 年，英国学者Russell和Burch 最早在著名出版物Theprinciples of humane experimentaltechnique （人道主义实验技术原理） 中系统提出“3R” 原则，即通过使用无知觉的材料代替（replace）有意识的活体高等动物
4、，在确保获取一定数量和精度的信息前提下尽量减少（reduction） 动物使用量，采取优化措施（refinement） 减轻动物痛苦的发生和严重程度4。1978年，David Smith 在Alternatives toanimal experimentation 一书中将“3R”统称为“替代”（Alternatives）。“3R” 不仅是替代方法的发展方向，也是替代方法的代名词，更是动物实验替代方法的核心和主要研究内容。替代试验与“3R” 原则反映了实验动物科学由技术上的严格要求转向人道主义管理，在保证实验科学性的前提下尽可能地减少实验动物的使用、减轻或消除动物痛苦，提倡实验动物福利与动物保
5、护2。20 世纪下半叶，全球各地替代方法研究和验证机构的成立推动了全球替代方法的推广和应用4-6。至20 世纪80 年代，动物保护组织反对化妆品的动物测试，以欧盟为首的多个国家和地区实施化妆品动物实验禁令；到2022 年9 月，美国参议院通过FDA 现代化法案FDA Modernization Act 2.0 ，其中提到终止“动物实验强制令”，标志着动物实验在全球多个国家和地区由“强制执行” 转为“强制禁止”。化妆品的安全性和功效性评价在保障化妆品质量和消费者使用安全方面具有重要意义，尤其是随着国际动物福利和“3R” 理念的发展与科学技术的进步，越来越多的替代新方法、新工具被应用到化妆品评价中
6、。在药物研发领域，FDA 于2022 年9 月提出新的指导方针，要求减少动物试验并尽量利用动物实验替代技术取代动物试验。化妆品领域，目前世界范围禁止动物实验主要有两种模式：一是欧盟、印度等采用的一刀切形式，全面禁止各种动物实验；二是依据科学的发展规律，切实考虑到安全性评价的实际需要，只禁止部分存在其他优选方法的动物实验，分阶段试行，其中我国和日本等国家采用后者。全球化妆品动物替代的发展历程世界动物保护组织很早就提出疑问，化妆品仅仅是为了人类自己的美丽，而要给动物带来痛苦和死亡，这不符合人道主义，这也是目前国际上反对进行化妆品动物实验的主要理由。而这种动物保护主义的呼声客观地推动了动物替代方法在
7、化妆品毒性实验中的研究和开展。“3R” 理论的提出，影响着世界各国有关实验动物法规的研究和制定，并激励着科学家和研究机构投入替代技术开发7。1969 年，英国成立了医学试验用动物中替代法基金会（FRAME），成为全球最早的替代方法研究机构，此后世界各国相继成立替代方法研究和验证中心，开展替代方法的研究、验证、标准化和推广应用。1994 年，世界经济合作和发展组织（OECD） 开始编制替代方法的验证指南。这些替代方法验证机构的成立，使得大量研发投入产生的新技术、新方法和新产品有了被法规认可的渠道，推动了替代技术的进步。其中，经替代方法验证中心认可的试验方法可以申请纳入OECD、人用药物注册技术要
8、求国际协调会（ICH）、国际化妆品监管合作组织（ICCR） 或其他国家地区的法规标准。2013 年3 月11 日起，欧盟完成了化妆品及成分的動物试验禁令和销售禁令的实施，给全球法规和替代方法的研究带来深远的影响8-9。2008 年，ICCR 成立替代试验方法国际合作组织（ICATM） 相关工作组，以加强技术交流与合作，并逐步对已有替代方法组织讨论，并列出认为可用于化妆品的方法，涉及皮肤刺激性/ 腐蚀性、光毒性、眼刺激性/ 腐蚀性、急性毒性、内分泌干扰物、基因毒性等，多为OECD 发布方法。随后几年，逐步对列举方法做出更新10。我国科技部最早于1997 年在“九五” 和“十五” 计划期间将动物实
9、验替代研究列入实验动物基础性研究的重点内容，明确指出动物实验应遵循“3R” 原则，并于2006 年发布了关于善待实验动物的指导性意见。2011年，国家药品监督管理局启动化妆品动物实验替代方法体系研究项目；2018 年，中检院成立全国化妆品替代方法研究与验证工作组。但截至目前，我国尚无“3R” 立法及国家层面的替代中心来主导替代方法的研究和验证工作。到2016 年，首个替代方法被纳入化妆品安全技术规范，标志着我国正跟随国际化妆品替代的步伐，稳步推进化妆品产业的国际化水平（见图1）11，12。我国化妆品动物实验替代方法的现状随着科学技术的进步和化妆品动物禁令的不断推广 ，动物替代试验的发展和应用成
10、为化妆品评价中的重要课题。我国在动物替代试验技术研究和方法推行方面起步较晚，但在化妆品动物替代试验方法标准认可方面紧随国际标准的发展趋势。2016 年，化妆品用化学原料体外3T3 中性红摄取光毒性试验方法是首个被纳入化妆品安全技术规范（2015 年版）（以下简称“规范”） 的替代方法。截至目前，我国已有近10 项替代方法被列入规范，此外还在同步针对多项OECD 验证的方法进行研究、验证和转化。但目前我国化妆品行业发展和产品注册备案对动物实验替代方法仍然需求迫切，化妆品替代标准不足和必需的细胞、模型或试剂等存在国际技术垄断的现状，因此，重点研发具有自主知识产权、助力产业、服务注册备案的靶标细胞系
11、、3D 组织、器官芯片、低等模式生物等模型及技术是我国化妆品行业未来替代方法发展重点关注的方向（见表1）13，14。下一代替代理念与技术的兴起随着生命科学技术的快速发展，全球替代方法进入快速发展阶段，在21 世纪毒性测试新观念（TT21C）、整合测试评估策略（IATA）、有害结局通路（AOP）、下一代风险评估（NGRA）等理论的指导下出现一系列的新技术、新方法， 如靶标细胞模型、器官芯片、低等模式生物、计算毒理学等高通量的动物实验替代新技术。传统的替代技术，主要体现为动物实验系统向体外实验系统转换而建立的方法，如体外细胞培养、离体器官等。在现代替代方法中，则体现在充分理解生物学过程及在分子机制
12、的基础上结合现代生物科学技术及信息技术，如非生物测试技术（如定量构效关系、交叉参照、分类法、毒理学阈值、计算毒理学等）、基因编辑技术、组学技术（基因组、转录组、蛋白组、代谢组、脂质组）、基于微生理的组织工程技术、干细胞技术、图像识别技术、计算机模拟技术等，使替代方法更多元化，也更符合人整体的生理病理过程15-18。1. 整合测试评估方法与有害结局路径评价技术由于单一替代方法存在局限性和适用性问题，因此在毒理学全面评估中可参考OECD 发布的整合测试与评估方法（IATA） 指南，进而合理地、科学地采用单一方法的组合模式。评估过程不仅可以考虑现有的测试方法，还加入计算机预测方法、化学结构特征信息、
13、人群暴露等。此外，对于复杂的毒性终点的风险评估，也可以采用IATA，以避免单一替代方法无法完整覆盖有害结局路径（AOP） 全过程的局限。如OECD 于2016 年通过皮肤致敏AOP 框架，皮肤致敏的 AOP 事件总共包含 4 个“关键事件”：关键事件 1（KE1） 分子启动事件是亲电物质与皮肤中的亲核中心共价结合，为分子层面的表达（替代方法为DPRA，ADRA）；KE2 事件是角质细胞的活化，为细胞水平的表达（替代方法为KeratinoSensTM，Lusens）；KE3 是树突状细胞的活化，为细胞水平的表达（替代方法为h-CLAT，U-SENS，IL-8-Luc）；KE4 是 T 细胞活化和
14、增殖，为组织器官层面的表达检测（替代方法为LLDA）19，20。2. 基于干细胞的评价技术干细胞具有无限增殖及分化潜能，利用人胚胎干细胞（ESCs） 或诱导的多能干细胞（iPSCs） 技术，为替代方法的研究提供了稳定的人源化干细胞衍生细胞的来源，有望在一定程度上解决物种间外推的需要。例如，利用iPSCs 定向诱导分化肾近端小管上皮细胞，可用于评价靶器官毒性的替代方法开发；利用iPSCs 定向诱导分化角质形成细胞、成纤维细胞等多种皮肤组织的细胞类型，可用于构建体现皮肤结构与功能特征的人源化的表皮、全皮和功能性皮肤类器官模型。但多能干细胞诱导形成各类组织细胞类型的一致性、稳定性和功能性是干细胞技术
15、应用于替代方法开发中需要解决的关键问题5，21。3. 基于组学分析的评价技术近年来，基于人体遗传物质信息传递及机体代谢流程的多组学技术，包括基因组学（遗传信息）、转录组学（基因转录的信使RNA）、蛋白质组学（基因表达产物蛋白质）、代谢组学（代谢产物）、脂质组学（脂质类代谢产物）、微生物组学（与人体共生的微生物，如细菌、真菌等） 在内的组学技术得到了快速发展。人们逐渐从过去关注某一个基因、蛋白或代谢产物的变化转向关注整体调控网络的变化，这使研究者们从更为宏觀的角度去发现生物体生理代谢的整体微观变化，有助于推动建立更有效的安全性评估策略和毒性预测技术5，15。4. 基于组织工程的评价技术器官芯片是
16、由微流控设备与活细胞结合而成的微型结构，可在体外重现体内器官的生理和病理特征。尽管ICCR 将器官芯片技术应用于化妆品原料风险评估中被认为是目前尚不足以成熟运用的方法。但2022 年8 月，FDA批准了全球首个完全基于“类器官芯片” 研究获得临床前数据的新药进入临床试验（NCT04658472），成为行业里程碑事件。模拟皮肤结构的3D 皮肤模型是组织工程技术在皮肤方面的成功应用实例。由于进口3D 皮肤模型的储存、运输以及使用的时效性问题，OECD 中的替代方法TG 431、439、498，利用3D 皮肤器官芯片进行化妆品原料或成品的皮肤腐蚀性、刺激性、光毒性等安全性测试，目前在我国尚未推广应用。因此，构建自主知识产权3D 组织器官模型，建立皮肤芯片、多器官级联系统，如结合微流控技术构建3D肝皮肤、肾皮肤双器官芯片模型，通过理化试验方法
