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1、 基于网络药理学及分子对接技术探讨柏子养心丸治疗失眠症的作用机制 马贝贝，田颖颖，杨海润，王婷婷，张志聪，杨硕，曹欣垚，左泽平*，王志斌*1.北京同仁堂股份有限公司科学研究所，北京 1000792.北京中医药大学 中药学院，北京 102488睡眠作为一种与人类健康息息相关的重要生理活动，有益于神经系统的能量储存与恢复，辅助机体学习记忆行为的顺利完成1。近年来失眠症已成为临床最为常见的睡眠障碍2，持续的睡眠启动与维持困难导致的睡眠质量和时间无法满足日间需求的主观体验使大部分患者长期遭受焦虑、头痛、间歇性遗忘等症状的困扰3，并时刻暴露于罹患抑郁、心脏病、高血压、肥胖的风险之下4。据世界卫生组织报告
2、，全球约1/3 的普通人群患有持久性睡眠障碍，约有50%个体一生中均会经历失眠症状5。现今医学界常用的失眠症治疗药物主要包括苯二氮类、三环类抗抑郁药及褪黑素等，虽可发挥诱导催眠效果，但频繁使用会引发呼吸抑制、肾功能损害、反弹性失眠及戒断反应等，一些药物如氯硝西泮和格鲁米特甚至会导致认知功能丧失6。中医药作为一种备受推崇的补充与替代医学手段可为失眠症医治提供可靠的选择方案。柏子养心丸作为一类传承源远、应用广泛、普遍认可的中医经典名方，首载于明代医家彭用光所著的体仁汇编中，而后在古今医统大全景岳全书及汤头歌诀等诸典籍中多有出现，现今被收录于全国中药成药处方集中华人民共和国药典2020 年版一部及国
3、家基本药物目录中。柏子养心丸全方具有补气、养血、安神之功，适用于心血亏损、怔忡惊悸、失眠健忘、盗汗多梦等症候，临床多用于治疗心脾两虚型失眠、慢性焦虑症及心律失常等。据报道，柏子养心丸可明显延长戊巴比妥干预小鼠的睡眠时间，增加其睡眠动物数（入睡率）7。此外，柏子养心丸联合参芪五味子片、归脾汤及穴位针刺等治疗各种失眠症疗效均显著8。但目前国内外学术界尚未有柏子养心丸作用机制研究的相关报道，且其质量标志物鲜有探讨，这将严重阻碍其质量标准建立与临床应用推广。网络药理学是一种源于系统生物学、多重药理学和分子网络的新方法9-10，“网络靶点”作为其核心概念可从生物网络角度分析中药方剂的药效物质基础，运用现
4、代生物信息学技术指导中药质量标志物的发现，剖析多组分药物在生物体内的作用机理，从分子水平整体阐释疾病、人类生物系统和药物靶标之间的复杂关系11，这正与中医药“多靶点、多途径调控”及“整体辨证论治”的理论观念相一致，从而成为全面、系统解析中药复方作用机制的强大工具，由此被广泛应用于各类中医药经典方剂的有效成分确定、潜在靶点识别及干预通路挖掘。分子对接是一种基于计算机智能模拟工具预测分子与蛋白质之间的相互作用、结合模式及亲和力的药物辅助设计和筛选技术，其结果准确，成本低廉，已被逐渐用于中药方剂的活性成分评价研究。因此，本研究通过整合网络药理学方法与分子对接技术对柏子养心丸的活性成分、调控靶标及作用
5、机制进行多层次、多维度的全面探索，旨在明确其作用靶点，确认其质量标志物，为下一步的功效通路精准定位及质量评价体系构建提供科学参考。1 资料与方法1.1 柏子养心丸的活性成分筛选及靶点收集通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索柏子养心丸整方中柏子仁、党参、黄芪、川芎、当归、茯苓、远志、酸枣仁、肉桂、五味子、半夏、甘草、朱砂13 味药材的化学成分，以生物利用度（OB）30%及类药性（DL）0.18为界定值筛选活性化合物，并搜集其调控靶点，而后利用Uniprot 数据库对所有靶点基因进行ID 名称规范。1.2 失眠症的治疗靶点收集以“insomnia”“dyssomnia”“sleep
6、 disorder”等与失眠症定义相关的专业术语为Key，在GeneCards 数据库（https:/www.genecards.org/，Relevance score值1）、OMIM数据库（https:/omim.org/）、PharmGKB 数据库（https:/www.pharmgkb.org/）、TTD 数据库（ 数据库（ 个数据库的靶点信息，剔除重复基因后即为失眠症的治疗靶点库。1.3 柏子养心丸活性成分-失眠症治疗靶点蛋白相互作用（PPI）网络构建与分析以柏子养心丸活性成分的调控靶点及失眠症的治疗靶点库为基础，使用R 语言程序包“venn”将二者取交集并绘制韦恩图，并进一步将交集
7、靶点上传到STRING 数据库（https:/string-db.org/）进行蛋白相互作用分析，设定“Organisms”为“Homo sapiens”，设定“minimum required interaction score”为0.9，生成的PPI 网络图导入到Cytoscape 3.9.1 软件中，利用CytoNCA 工具计算各网络节点的连接度（degree）、介度（betweenness）及紧密度（closeness）等参数，以R 语言程序对每个参数进行中位值过滤循环，寻找PPI 网络中的核心靶点，并基于此构建PPI 核心作用模块。1.4 柏子养心丸治疗失眠症作用靶点功能与通路的富集
8、分析使用R 语言中的“BiocManager”平台加载“org.Hs.eg.db”程序包，并将以上所述的柏子养心丸活性成分作用靶点与失眠症治疗靶点库的交集靶点基因symbol 名称转换为entrezID，而后再采用R语言“clusterProfiler”“enrichplot”“ggplot2”“pathview”等程序包对交集基因进行基因本体（GO）功能富集与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，设置P值过滤条件为0.05，选取GO 富集结果中生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）3 个模块各前10 个基因功能集合及KEGG 富集结果中前30 条通路以条形图（bar
9、plot）和气泡图（bubble）的形式进行可视化。1.5 柏子养心丸活性成分-治疗失眠症作用靶点网络图的构建使用Cytoscape 3.9.1 软件将柏子养心丸治疗失眠症的作用靶点（交集靶点）与其关联的活性化合物的相互关系绘制成网络图，并采用内置的CytoNCA 工具分析整个网络中成分与靶点各个代表节点的度、介度及紧密度，根据网络拓扑学参数探讨柏子养心丸治疗失眠症的关键药效成分与核心作用靶点。1.6 柏子养心丸关键成分与核心靶点的分子对接验证将分析得到的柏子养心丸关键药效成分导入PubChem 数据库（https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）进行检索，下载其2D 结
10、构后使用ChemOffice 套件中的Chem3D 软件转换为3D 结构；同时，结合Uniprot 数据库查询到的核心靶点的“Entry Identifier”进一步搜索RCSB PDB 数据库（https:/www.rcsb.org/）下载其三维空间结构，使用开源Pymol 软件删除其中的水分子与有机小分子，而后导入AutoDockTools 1.5.7 软件进行加氢、加电荷操作，设置Gridbox 参数确定对接范围，最后采用AutoDock Vina 1.1.2 软件进行分子对接验证，根据配体-蛋白对接模型的最低结合能判断成分与靶点的亲和能力，使用Pymol 软件将对接结果可视化。1.7
11、柏子养心丸关键活性成分与潜在靶点的二次挖掘为了避免在网络药理学生物信息筛选过程中出现潜在活性成分与调控靶点的遗漏现象，本研究再次以PPI 核心作用模块中的关键靶点为源头，反向追溯其关联的柏子养心丸化学成分，并使用Pymol、AutoDockTools 1.5.7、AutoDock Vina 1.1.2系列软件对这些化合物与核心靶点进行分子对接考察，根据结合能的大小确定潜在的活性成分与作用靶点，以期更全面阐释柏子养心丸治疗失眠症的作用途径，补充完善其质量标志物。2 结果2.1 柏子养心丸活性成分与靶点的筛选利用TCMSP 数据库初步提取并经ADME 筛选后共得到柏子仁化学成分5 种，半夏化学成分
12、13种，川芎化学成分7 种，当归化学成分2 种，党参化学成分21 种，茯苓化学成分15 种，甘草化学成分92 种，黄芪化学成分20 种，酸枣仁化学成分9种，合并后共得到167 个活性化合物，见表1。进一步收集其相关作用靶点，合并后共得264 个调控基因。表1 柏子养心丸中的活性成分Table 1 Active ingredients in Baizi Yangxin Pills2.2 失眠症疾病相关靶点的获取从GeneCards 数据库收集疾病靶点323 个，从TTD 数据库收集疾病靶点26 个，同时结合OMIM与PharmGKB 数据库搜集结果补充相关靶点，最后，从DrugBank 数据库收
13、集用于失眠症治疗的临床一线药物治疗靶点178 个。合并以上5 个数据库的搜集结果，剔除重复基因，共计得到失眠症干预靶点475 个，各数据库靶点的收集合并情况见图1。图1 失眠症相关靶点Fig.1 Related targets of insomnia2.3 柏子养心丸作用靶点-失眠症基因PPI 网络分析使用R语言平台将收集到的柏子养心丸调控靶点与失眠症基因取交集，绘制韦恩图，见图2，获得二者的共同靶点69 个。将共同靶点上传到STRING 平台绘制PPI 网络，见图3。为了更准确剖析柏子养心丸治疗失眠症的潜在分子机制，将PPI 网络导入Cytoscape 3.9.1 软件进行节点区分与区域可视
14、化，采用内置的CytoNCA 工具计算各节点的degree、betweenness、closeness 参数，以R 语言程序对每个参数进行中位值过滤循环，发现PPI网络中的核心靶点包括丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK3）、CXC 型趋化因子配体8（CXCL8）、细胞色素P450 3A4 酶（CYP3A4）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、细胞色素P450 家族成员1A1（CYP1A1）等，PPI 核心互作模块见图4。图2 柏子养心丸作用靶点与失眠症基因交集韦恩图Fig.2 Venn diagram of the intersection between the targets of Baizi
15、 Yangxin Pills and insomnia genes图3 柏子养心丸-失眠症交集基因的PPI 网络Fig.3 PPI network of Baizi Yangxin Pills-insomnia intersection genes图4 PPI 网络中关键靶点的剖析与核心PPI 模块的构建Fig.4 Anatomy of key targets in PPI network and construction of core PPI modules2.4 GO 功能与KEGG 通路的富集分析使用R语言平台对柏子养心丸治疗失眠症的作用靶点进行GO 功能与KEGG 通路富集分析，结果显示，柏子养心丸主要参与的BP 主要为对外源性刺激的反应（response to xenobiotic stimulus）、对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、对养分水平的响应（response to nutrient levels）等；MF主要富集在G 蛋白偶联胺受体活性（G protein coupled amine receptor activity）、神经递质受体活性（neurotransmitter receptor activity）、突
