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1、 基于MAPK通路探究下调miR-15b对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用 谭玉婷 宋业琳 蔺亚东 任华风(1青岛大学附属青岛市海慈医院(青岛市中医医院)心血管科,山东 青岛 266033;2青岛市第五人民医院;3青岛大学附属青岛市海慈医院(青岛市中医医院)功能检查科)心肌细胞缺血再灌注损伤是指缺血心肌在恢复血液再灌注后,加重其结构破坏,引起细胞死亡,致使心肌梗死范围扩大,造成心脏功能的进一步损害,并影响心肌梗死患者的预后1,2。有多篇报道指出35,由于活性氧产生的过多或抗氧化酶活性减低,则可引发链式脂质过氧化反应,损伤细胞膜并进而使细胞死亡,从而加重了心肌受损。虽然早期进行再灌注治疗可恢复相
2、关血管的功能,并避免心肌坏死的发生,但原病灶处已出现相应的病变,尤其是心肌收缩功能及血管内皮功能等一系列损伤性变化,在行心肌再灌注治疗后表现得更为明显,有发生心律失常甚至猝死的风险。本研究探究基于MAPK通路探究下调微小RNA-15b(miR-15b)对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用。1 材料与方法1.1材料 研究动物:48只大鼠购自河南祺祥科技生物有限公司SYXK(豫)2021-0001,体质量250310 g,平均(266.0028.50)g,光照12 h/d,喂养大鼠1 w,本研究由医院伦理委员会进行批准通过。主要试剂:miR-15b(试剂盒:艾美捷科技有限公司,abx096787);
3、肿瘤坏死因子(TNF)-酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海广锐生物科技有限公司);白细胞介素(IL)-6 ELISA试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司,70-EK106/2-96);丙二醛(MDA)ELISA试剂盒(北京义翘神州科技股份有限公司,RG80464-ACG)、超氧化物歧化酶(SOD,北京伊塔生物科技有限公司,SY6458);丝裂原活化蛋白激酶(MAPK,上海烜雅生物科技有限公司,P1024);p-p38(上海广锐生物科技有限公司,ET3469);磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK,上海梵态生物科技有限公司,FT-D24084)。1.2慢病毒载体构建 miR-15b表
4、达下调的慢病毒载体构建,重组miR-15b下调病毒载体(Lentiviral-mediated-Rbfox1)并经测序验证,病毒滴度为108 TU/ml,制备完成将重组慢病毒载体在-80 保存。1.3分组及建模 将事先购买并喂养1 w的大鼠分为4组,其中12只作为空白组大鼠不做处理,其余3组依据王玉梅等6研究实验大鼠。构建方法:确保每只大鼠均禁食超过12 h,注射10%水合氯醛进行麻醉处理,麻醉生效后将其固定在夹板上,连接呼吸机及心电图进行实时监测生理状况,在大鼠胸部左侧34肋间处剪开其皮肤并分离各层肌肉并露出肋骨,持剪刀剪开第3、4根肋骨,并拉开胸壁,暴露其心脏,用止血钳将胸腺夹住,将左心耳
5、与肺动脉圆锥间穿7-0丝线。缺血再灌注组麻醉后开胸,断34肋,打开心包膜,暴露心脏,于冠状动脉左前降支根部穿线(0号缝合线),结扎阻断血流,根据心电图ST段抬高情况判定阻断成功后30 min解除阻断,根据心电图ST的回落情况判定实现再灌注,缝合胸壁,大鼠恢复自主呼吸。1.4miR-15b表达量 采集所有大鼠心肌组织,2 000 r/min 4 离心10 min。miRNA采用mirVana PARIS Kit试剂盒提取纯化。离心后收集miRNA。miR-15b上游引物:5-ACGGTCGAGCTTAGA-AG-3,下游:5-GCTGTTTGTCTGGCTGCTGCTCCG-3。U6上游引物:5
6、-CTGGGTCGAAACGCTCGTCT-3,下游:5-CAGTGCGACTAGAGCCACTAG-3。反应条件:95 5 min;95 10 s,60 30 s,72 205 s,共进行40个循环,采用2-Ct方法计算出miR-15b表达量。1.5IL-6、TNF-、MDA、SOD水平检测 抽取大鼠清晨尾部血2 ml,离心处理10 min,分离出的上层血清,在-45 环境下保存,采用ELISA检测IL-6、TNF-、MDA、SOD;首先在酶标板上进行标记,并配制稀释标准品。取100 l血清样品及标准品放入反应孔上,孵育32 min,使用洗涤液清洗3次酶标板,加入100 l酶标工作液,避光孵
7、育32 min,使用洗涤液清洗3次酶标板,加入100 l的3,3,5,-四甲基联苯胺(TMB)显色液,避光孵育12 min,显色后加入终止液,450 nm处测吸光值,颜色深浅与IL-6、TNF-、MDA、SOD呈正比,经绘制标准曲线计算IL-6、TNF-、MDA、SOD。1.6病理组织学观察 各组大鼠腹腔注射80 mg/kg的3.0%戊巴比妥麻醉,迅速取分离心肌组织,将提取的心肌组织制作成标本,用4%多聚甲醛固定,室温下用15%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙、脱水后用石蜡进行包埋,作3 m的切片,进行苏木素-伊红(HE)染色处理,使用光学显微镜观察大鼠病理变化。1.7MAPK信号通路 采用Wes
8、tern印迹检测,取所有心肌细胞缺血再灌注损伤大鼠心肌组织蛋白。提取50 g蛋白,把5蛋白缓冲液注入41的体积中。按15 000加入稀释山羊抗兔IgG,孵育60 min室温水平摇床,洗涤5次Westem洗涤液,每10 min 1次。经过电化学发光(ECL)显色和曝光后,进行BIO-RAD成像,检测条带的灰度值,分析统计结果。1.8统计学处理 采用SPSS26.0软件进行t检验、方差分析。2 结 果2.1病理组织学观察 空白组心脏组织结构正常,且心肌细胞排列整齐,未见心肌细胞肥大、变性,横纹清晰。模型组心肌细胞肿胀,且少数心肌细胞溶解坏死,部分心肌细胞质疏松。上调组部分心肌细胞核增大,部分血管周
9、围心肌细胞溶解坏死,且心肌间质可见灶状炎细胞浸润。下调组心肌细胞横纹变浅,心肌间质未见明显急性慢性炎细胞浸润及纤维细胞增生。见图1。图1 各组心脏组织病理(HE染色,400)2.2各组miR-15b表达量比较 与空白组比较,模型组、上调组和下调组miR-15b表达量明显升高(P0.05);与模型组比较,上调组miR-15b表达量明显升高,下调组miR-15b表达量明显降低(P0.05);与上调组比较,下调组miR-15b表达量明显降低(P0.05)。见表1。表1 各组miR-15b表达、炎症反应、氧化应激反应、心功能指标比较2.3各组炎症反应情况对比 与空白组比较,模型组、上调组和下调组IL-
10、6、TNF-表达水平明显升高(P0.05);与模型组比较,上调组IL-6、TNF-表达水平明显升高,下调组IL-6、TNF-表达水平明显降低(P0.05);与上调组比较,下调组IL-6、TNF-表达水平明显降低(P0.05)。见表1。2.4各组氧化应激情况对比 与空白组比较,模型组、上调组和下调组MDA、SOD表达水平明显升高(P0.05);与模型组比较,上调组MDA、SOD表达水平明显升高,下调组MDA、SOD表达水平明显降低(P0.05);与上调组比较,下调组MDA、SOD表达水平明显降低(P0.05)。见表1。2.5各组心功能指标比较 与空白组比较,模型组、上调组和下调组LVEDP表达水
11、平升高,LVSP表达水平降低,差异有统计学意义(P0.05);与模型组比较,上调组LVEDP表达水平升高,LVSP表达水平降低;下调组LVEDP表达水平降低,LVSP表达水平升高,差异有统计学意义(P0.05);与上调组比较,下调组LVEDP表达水平降低,LVSP表达水平升高,差异有统计学意义(P0.05)。见表1。2.6各组MAPK信号通路表达量比较 与空白组比较,模型组、上调组和下调组MAPK、p-p38、p-JNK表达水平明显升高(P0.05);与模型组比较,上调组MAPK、p-p38、p-JNK表达水平明显升高,下调组MAPK、p-p38、p-JNK表达水平明显降低(P0.05);与上
12、调组比较,下调组MAPK、p-p38、p-JNK表达水平明显降低(P0.05)。见表2、图2。表2 各组MAPK信号通路表达量比较图2 Western印迹检测各组MAPK信号通路蛋白3 讨 论心肌缺血后再灌注损伤指急性心肌梗死后,冠状动脉出现阻塞,甚至部分阻塞,经治疗后血管再通,血管损伤呈短暂加重的病理生理现象7。由于血液再灌注,心肌细胞在缺血期保持存活,而于再灌注期最终死亡8。目前认为心肌再灌注损伤中再灌注性心律失常,属于可逆性损伤,但是有潜在的致命性。miRNAs属于短小内源性单链非编码RNA片段,其片段长度约为22个核苷酸,现已被证实为能够对细胞起到一定调控作用的转录因子9。有相关数据显
13、示10,miRNAs主要通过自身能够形成miRNA诱导的下调复合物的机制在机体内发生相关因子作用。因此,miRNAs在机体各处细胞内均存在着一定的细胞生理活动,如对各种疾病的生长凋亡情况起到调控作用,近些年,miRNAs引起了相关学界专家对其广泛的关注11。本研究发现,miR-15b密切参与了调节心脏结构、血管生成、心肌肥大、再灌注损伤等病理生理过程,由此可分析,miR-15b在机体内可能属于较为关键性且起到调节作用的因子之一。近年研究报道中指出12,机体正常状态下的心肌组织中存在者两百余种miRNAs表达,当机体异常状态,心肌组织异常应激状态时,miRNAs表达会产生相应的改变,其中miR-
14、15b被认为与心肌组织应激状态的改变有直接性的关系,尤其是体现在心肌缺血再灌注状态下的机体中,miR-15b的相对表达量的变化更加显著,提示miR-15b可能存在着一定的调控及促进作用,由此得知,miR-15b可能对心肌细胞缺血再灌注损伤进行参与调节13。另有研究报道14,miR-15b家族在正常大鼠心肌细胞中呈现高表达,表达强度极高,当大鼠体内出现缺血再灌注损伤情况时,会对某些miR-15b家族的成员造成影响。本研究结果提示,miR-15b在心肌再灌注损伤的发展中起到关键性的作用。另有学者在文章中认为15,机体中广泛存在的miR-15b家族能够参与细胞的各种生理活动中,并起到一定的调节作用,
15、与多种疾病及肿瘤的发生有关。经本研究结果推测,miR-15b可能在心肌细胞缺血再灌注损伤诱导的凋亡的过程中进行参与和调节,该过程信号转导机制有待进一步研究,为防止再灌注损伤及细胞凋亡率的降低,提供一定切实可行的理论基础。心肌细胞缺血再灌注的形成是一个极其复杂的过程,其发生机制包括应激反应及炎症反应发生改变等造成机体相关功能紊乱,对心膜通透性造成极大的损伤,导致心肌细胞缺血再灌注的发生16。经本文研究发现,MDA水平与细胞损伤程度之间存在一定联系,SOD活性程度能够对机体内内源性抗氧化能力进行一定程度的反映。MDA、SOD水平的降低能够改善机体氧化应激状态,提升机体自由基清除能力17。IL-6、
16、TNF-与炎性反应及心肌细胞缺血再灌注损伤密切相关。据相关研究指出,IL-6、TNF-是对心脏术后所产生的各种并发症的严重程度进行衡量的重要指标18。本研究发现,在心肌细胞缺血再灌注损伤后,促炎性细胞因子水平的升高增加了心肌损伤,使促炎性细胞因子释放增多从而形成恶循环。本研究结果显示,通过对miR-15b表达水平进行下调,能够及时终止恶性循环,以此来改善大鼠的LVEDP、LVSP水平,对心肌功能起到一定保护作用。MAPK信号通路在机体内属于较为关键重要的信号转导系统,涉及细胞的生长及发育,与炎症及肿瘤、心血管疾病的发生密切相关,调控MAPK信号通路可降低心肌缺血程度及梗死程度,改善心功能及炎症反应1921。本研究说明,在疾病发病机制中M
