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1、第2章 细胞工程第2节 动物细胞工程第3课时 动物体细胞核移植技术和克隆动物“（悟空）拔一把毫毛，丢在口中嚼碎，望空喷去，叫一声变！，即变作三二百个小猴，周围攒簇（c）。”这是西游记中的一段描述，展示了中华先贤的想象力。毫毛来自体细胞，我们能用体细胞“变”出一群猴吗？中华先贤的想象力2017年11月27日，世界上首个体细胞克隆猴“中中”在中国科学院神经科学研究所（上海）、脑科学与智能技术卓越创新中心的非人灵长类平台诞生（苏州）；12月5日第二个克隆猴“华华”诞生。2017年，中国的科学家将这一幕变成了现实其实，自1996年首个体细胞克隆动物多莉羊（Dolly）诞生以来，人类已经成功克隆了马、牛
2、和猪等大型家畜，但为什么体细胞克隆猴的诞生能轰动世界呢？克隆多莉羊（Dolly）问题我们能否利用类似植物组织培养获得完整植物体的方法培养动物细胞，使其发育成一个完整的个体？不能，高度分化的植物细胞仍保持着全能性，而动物细胞的全能性会随细胞分化程度的提高逐渐受到限制，分化潜能逐渐变弱。因此，目前还不能用类似植物组织培养的方法获得完整的动物个体。实现方法：动物体细胞核移植技术1.概念：将动物的一个细胞的细胞核，移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。2.原理：动物细胞核的全能性卵母细胞动物细胞去核取核移入重组细胞发育新胚胎发育克隆动物用核移植方法得到的动物
3、称为克隆动物一、动物细胞核移植技术一、动物细胞核移植技术3.生殖方式：无性生殖卵母细胞动物细胞取核去核移入重组细胞发育新胚胎发育克隆动物动物的一个细胞（胚胎细胞或体细胞）的细胞核去核的减数分裂中期（M期）的卵母细胞（1）供体：（2）受体：4.动物细胞核移植的供体和受体一、动物细胞核移植技术卵母细胞动物细胞取核去核移入重组细胞发育新胚胎发育克隆动物卵母细胞动物细胞取核去核移入重组细胞发育新胚胎发育克隆动物（1）去核目的：保证克隆动物的核基因全部来自供体细胞，”核“指的是纺锤体-染色体复合物。5.去核的减中期（M期）卵母细胞细胞质内存在激发细胞核全能性表达的物质；细胞体积大，便于操作；卵黄多，营养
4、物质丰富。一、动物细胞核移植技术（2）作为受体的原因受精卵囊胚胎儿成人6.分类与比较（1）分类体细胞核移植：动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难（2）比较：动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植一、动物细胞核移植技术胚胎细胞核移植：动物胚胎细胞分化程度低，表现全能性相对容易非人灵长类动物的体细胞核移植非常困难，原因是什么？一、动物细胞核移植技术 “多莉”是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物。这一巨大进展证明了分化了的动物细胞核具有全能性。7.非人灵长类动物体细胞核移植非常困难的主要原因（1）供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的功能状态，这导致了胚胎发育率低。（2）
5、对非人灵长类动物胚胎进行操作的技术尚不完善。一、动物细胞核移植技术一般指DNA分子扩增，如PCR技术，还包括单克隆抗体技术。由一个细胞分裂所形成的细胞群体，如动物细胞培养技术、植物细胞培养技术。分子水平：细胞水平：个体水平：在生物学上，克隆是无性繁殖，具体地说，是指一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来的一群遗传特性相同的分子、细胞或个体。延伸拓展：克隆（Clone）克隆技术：是一个很广的概念，凡指新形成的事、物与亲本一致的现象均可称为“克隆”。指基因型完全相同的个体或群体，如植物组织培养技术、核移植技术。二、体细胞核移植的过程应用体细胞核移植技术，我国已成功地克隆了牛、羊、猪和猴等多种哺
6、乳动物，以克隆高产奶牛为例，说明体细胞核移植的过程。甲猴丙猴乙猴克隆猴：“中中”和“华华”二、体细胞核移植的过程乙乙甲甲体细胞体细胞卵母细胞卵母细胞提取提取提取提取取核取核去核去核体外培养体外培养早期胚胎早期胚胎胚胎移植胚胎移植丙丙生生产产克隆牛克隆牛重组细胞重组细胞二、体细胞核移植的过程（以克隆高产奶牛为例）将胚胎移入受体（代孕）母牛体内二、体细胞核移植的过程（以克隆高产奶牛为例）重构胚早期胚胎电融合法使两细胞融合激活卵巢采集牛卵母细胞去核的卵母细胞供体细胞核移植高产奶牛生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛显微操作去核取体细胞将胚胎移入受体（代孕）母牛体内二、体细胞核移植的过程（以克隆高产奶
7、牛为例）体外培养到M期培养注入1.卵母细胞去核二、体细胞核移植的过程（2）目前动物细胞核移植技术中普遍使用的去核方法是显微操作法。也有人采用梯度离心、紫外线短时间照射和化学物质处理等方法。这些方法是在没有穿透卵母细胞透明带的情况下去核或使其中的DNA变性。（1）卵母细胞去核的原因：保证克隆动物的核基因全部来自供体细胞。1.卵母细胞去核（3）“去核”去的是实际上是去除纺锤体-染色体复合物，由于M期卵母细胞核的位置靠近第一极体，用微型吸管一般一并吸出第一极体。二、体细胞核移植的过程次级卵母细胞第一极体M期：减数第二次分裂中期2.核移植操作将供体细胞整个注入去核卵母细胞（1）操作简单，对卵母细胞损伤
8、较小；（2）保证供体细胞的细胞核不被破坏。二、体细胞核移植的过程3.诱导细胞融合的方法和结果：电融合法；形成重构胚。4.重构胚（2）激活方法：用物理或化学方法（如电刺激、Ca2+载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂）激活。（1）概念：是指人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。（3）激活重构胚的目的：使其完成细胞分裂和发育进程。二、体细胞核移植的过程早期胚胎培养动物细胞培养胚胎移植动物细胞融合重构胚早期胚胎两细胞融合激活重构胚采集牛卵母细胞，体外培养到M期去核的卵母细胞供体细胞培养核移植高产奶牛（供体）生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛显微操作去核取体细胞将胚胎移入受体（代孕）母牛体内动物体细
9、胞核移植5.整个过程中应用到的技术二、体细胞核移植的过程（1）动物细胞培养（2）动物细胞融合（3）早期胚胎培养（4）胚胎移植（5）动物细胞核移植思考：克隆牛的性别与哪头牛相同？为什么？性别与核供体牛相同，因为哺乳动物的性别是由性染色体组成决定，克隆牛的染色体全都来自供体牛。二、体细胞核移植的过程6.克隆动物的性别与核供体相同克隆牛提供卵母细胞的母牛思考：体细胞核移植方法生产的克隆动物，并不是对体细胞供体动物进行了100%的复制，为什么？代孕母牛出生与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛高产奶牛（核供体）二、体细胞核移植的过程（2）细胞质中的DNA（线粒体中的DNA）同时来自供体细胞和受体卵母细胞，一
10、部分性状和卵母细胞受体一致；（3）生物性状还受到环境因素的影响，克隆动物所生活的环境与核供体动物生活的环境不会完全相同。二、体细胞核移植的过程7.克隆动物的性状表现表现型=基因型+环境（1）克隆动物绝大部分DNA来自供体动物的细胞核，绝大多数性状和核供体一致；培养的动物细胞一般当传代至1050代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。思考：用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，这是为什么？二、体细胞核移植的过程思考：体细胞核
11、移植技术与诱导iPS细胞相比，有什么相似或不同之处？请你预测它们应用前景的差异。利用体细胞核移植技术和诱导iPS细胞都能生成干细胞，但它们的过程是完全不同的。通过体细胞核移植技术可以生成带有核供体细胞遗传物质的胚胎干细胞；诱导 iPS 细胞需要在细胞中表达几个关键基因，将细胞逆转到类似胚胎干细胞的状态。二、体细胞核移植的过程思考：体细胞核移植技术与诱导iPS细胞相比，有什么相似或不同之处？请你预测它们应用前景的差异。利用体细胞核移植技术和诱导iPS细胞都能生成干细胞，但它们的过程是完全不同的。体细胞核移植技术对核供体细胞有较高要求，一般情况下体细胞的分化程度越高，它重编程为干细胞的成功率就越低
12、；可诱导成为iPS细胞的细胞来源相对广一些，研究表明成纤维细胞、B淋巴细胞、脂肪干细胞等都可以诱导成为iPS细胞。二、体细胞核移植的过程思考：体细胞核移植技术与诱导iPS细胞相比，有什么相似或不同之处？请你预测它们应用前景的差异。利用体细胞核移植技术和诱导iPS细胞都能生成干细胞，但它们的过程是完全不同的。二、体细胞核移植的过程体细胞核移植技术涉及采集卵母细胞、去核、融合等复杂的操作；诱导iPS 细胞的技术流程相对简单，可能更适合用于生产实践。目前，科学家还在研究由这两种技术生成的干细胞在基因表达、DNA甲基化等方面的差异，这些研究成果也将直接影响它们今后的应用。治疗性克隆与iPS细胞治疗病人
13、取核去核卵母细胞重构胚胎各种细胞组织或器官诱导取出体细胞核移植移植成纤维细胞取出转入相关因子iPS细胞各种细胞组织或器官胚胎干细胞取出诱导移植治疗性克隆iPS细胞治疗细胞发生转化二、体细胞核移植的过程（1）在畜牧生产中，加速家畜遗传改良进程、促进优良畜群繁育。三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题1.应用前景通过建立转基因体细胞系，再利用此技术培育的转基因克隆动物，可作为生物反应器生产珍贵的医用蛋白。乳腺生物反应器（2）医药卫生领域换成核移植过程相关细胞三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题1.应用前景培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线，包括基因表达载体的构建、将目的基因导入
14、受体细胞、早期胚胎培养、胚胎移植等步骤，其中过程是将重组质粒导入受体细胞；过程需采用胚胎移植技术。治疗人类疾病时，转基因克隆动物的细胞、组织或器官，可作为异种移植。（2）医药卫生领域三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题1.应用前景猪的内脏构造、大小、血管分布与人的极为相似在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞，经诱导分化能形成相应的细胞、组织或器官，将它们移植给患者时可以避免免疫排斥反应。（2）医药卫生领域三、体细胞核移植技术的应用前景及
15、存在的问题1.应用前景研究克隆动物可以使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程。（3）在科研领域三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题1.应用前景克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来分析致病基因。克隆特定疾病模型的动物，还能为研究该疾病的致病机制和开发相应的药物提供帮助。三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题1.应用前景（3）在科研领域生物节律紊乱模型体细胞克隆猴 2019年1月23日，中国科学家正式宣布世界首批由体细胞克隆而来的疾病模型猴的诞生。克隆猴的来源是一只节律基因BMAL1被敲出的猕猴，以它为体细胞来源克隆出了5只遗传背景一致的生物节律紊乱猕猴。（4）在保护濒危动
16、物领域：该技术有望增加濒危物种的存活数量。黑草黄弄蝶白鳍豚金丝猴三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题（1）该技术的成功率非常低，各个技术环节有待进一步改进。（2）相对于技术研究，核移植的理论研究较为滞后，需要与发育生物学、细胞生物学和分子遗传学等学科更深层次的理论研究相结合。（3）绝大多数克隆动物存在健康问题，表现出遗传和生理缺陷，如体型过大、异常肥胖、发育困难、脏器缺陷和免疫失调等。三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题2.存在的问题胚胎移植 动物幼体产出概率1001 2003年，世界上第一只用体细胞克隆的动物多莉，因患有严重的肺部疾病被实施了安乐死。它只活了7岁，而普通绵羊的平均寿命在12岁左右。多莉的死亡引发了关于克隆动物是否早衰的争论。知识 拓展（P55）一些研究者认为，克隆动物的端粒比较短，基因表达不正常，早衰是一种必然现象。另一些研究者则认为，克隆动物的遗传物质是正常的，目前发现的早衰迹象是在克隆过程中的一些技术问题造成的；或者克隆动物在发育过程中出现了变异，早衰只是偶然现象。1.假设世界上最后一头野驴刚死亡，以下使它复生的方案中可行的是（）A.将野驴的基因导入家
