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1、TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（通用）（BIOTIN标记POD法，适用于细胞、组织样本）一 TUNEL检测原理凯基TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素（biotin）标记 的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3 -OH末端，并 可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP ）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB） 的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数 凋亡细胞；由于
2、正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用 于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。二TUNEL试剂盒组分组份20 assays50 assays100 assays储存条件Equilibration Buffer1.0 mL2.5 mL5.0 mL-20CBiotin-11-dUTP20p L50p L100p L-20CTdT Enzyme80p L200p L400p L-20C50XProteinase K珈L100p L200p L-20CStreptavidin-HRP10p L25p L50p
3、 L4C避光DAB2mg5mg10 mg-20C注意事项1使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。2因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心集液。3为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。4 TdT酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂 损耗。5另因DAB为固体粉末，使用前加入适量PBS溶解，配制成20XDAB（10 mg/ml）后，按下述方法显色使用。6用户自备：二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2、TritonX-100、柠檬酸钠、复染染液：苏木素或甲基绿等、盖玻片、载 玻片、染色缸。三操作流程概
4、览高灵敏度：可以单一检出初期的凋亡细胞。高特异性：能特异性染色凋亡细胞。快速操作：整体操作约需3小时。用途广泛：可应用于组织切片、细胞样本等。方便观察：使用光学显微镜观察实验结果。高正确性：有阳性对照片的制备方法，可以确认试剂盒的有效性四检测样本的预处理TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根据自已的样本材料及首次 试验结果来调整各个条件（参照Page9），如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客 观的试验结果。1细胞样本的准备.自螭细胞样本涂片或爬片）4浸入固定液，室遍（157250）固定15固走瑟 物净聚幡溶于PH7R
5、的PBSJ中，篮细绸P PPBS漂洗浸入封闭液中，辞 （15725V）封团lOifiin P（封闭液=物）H溶于甲醇）PPBS漂洗浸大通透液中，冰上政工）ISfSSmm+J通困虱a.l%THMnX-UH溶于叮嘲糠腰讷，霍维S睡）P进入痴I己反应详见Page 8） P操作注意事项:1. 为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。2. 固定好的样本可以在-20-C的70%乙醇中放置30分钟一晚，以改善细胞的渗透性。3. 使用PBS清洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。4. 进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。5. 固定液、PBS、封闭
6、液、通透液、染色缸需用户自备，请按上述方法配制。2石蜡组织切片的预处理例了二甲礴蜡2次，SitmVtk；乙醇水台100%、95%. 90%.Tim） u派人蛋白酶K工作嬴 如方（反成1530蛔旧 蛋白2uL 50XPr（rteinase K+9811L PBS） W浸大封翎液中，济 （15-251C ）封闭lOiiiin 封闭液=龄bH?O扁于单醇）4PBS漂洗二次/进入耘记反应详匣Page 8） 4PBS漂洗二次丫PBS漂洗二次丫*注意事项：蛋白酶K处理的使用浓度、处理时间及温度，都因组织的类型不同而有所不同，需要自已摸索优化上述条 件，如有问题，请根据本说明书Page 9的常见问题的原因及
7、推荐解决方案来调整条件。例如：如果凋亡细胞染色 较弱时，可用高浓度的Proteinase K （400“g/ml）处理5分钟。（本试剂盒的50XProteinase K浓度为1mg/ml）o其它替代方法：石蜡切片的预处理也可根据实际情况可采用下述三种替代方法之一，即蛋白酶K处理的步聚改用下述 方法，其余步聚均相同：替代方法匚将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min （通透液：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配 制）替代方法2：将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min （胃蛋白酶：0.25%-0.5%溶于HCl PH2,胰 蛋白酶 0.25%
8、-0.5%溶于 0.01N HCl ）替代方法3:将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH 6的塑料盒中，置于微波炉中350W （低档） 处理5 min。4其它难于处理的组织切片的预处理5阳性对照及阴性对照的准备TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照，以显示试验的客观性及准确性。因此需要按下述方法准备两个样本来制备阳性 及阴性片，其后续步聚与待测样本同样进行。A：阳性对照样本的准备组织样本在蛋白酶K处理、PBS浸洗后，细胞样本在Triton X-100通透液处理、PBS浸洗后，再加入100L DNase I 反应液(10U-3000U DNase I, 40mM Tri
9、s-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2)(用户自备)室温一37笆 处理10 30 min,其余步骤均相同。如有问题详见Page 9.B：阴性对照样本的准备在Page 8标记反应制备TdT酶反应液时，不添加TdT酶，其余步骤均相同。五标记和显色反应:PBS漂洗三洗 癖是微镜网察、拍原M 11*亲、甲基费5滴加EOpL戳repgdd吧P工作液，帷玻片箕谭间隆光反应30miy (Streirtanjdin-ffiP0.5uL Strentapidur-SRP-TSSn 5uL PES) 4播加SOiiL-lOOiiL BAB工俏旋，盏显色反应ll
10、htrinP 工裕蓦 5pL2QXM6十liiL3O%H隹十益PBS漂洗三次样本罔捐用唳水球日PBS漂洗三次4獭理好的样本PBS漂洗两次，样洋阔留用勒裸魅干w操作注意事项：1. 进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。2. PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布 于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。4. TdT酶反应液即用即配，短暂于冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。5. 如果20XDAB溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需
11、重新配制。6. 用甲基绿（Methyl Green）染液（3-5%甲基绿溶于0.1M醋酸巴比妥PH4.0）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲 基绿。然后进行洗净（100%乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用8090%的乙 醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。六常见问题的原因及推荐解决方案.现象 非特异性染色（例如：非凋亡细胞的强染色）现象可能原因建议非特异性染色Biotin-dUTP的非特异性结合勿使细胞干涸（例如：非凋亡细胞的强染色）在TdT酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml BSA 的 PBS 洗三次。Td
12、T酶的浓度过高用 TdT dilution buffer* 作 1： 21: 10 稀释，内源过氧化物酶未被封闭封闭液室温（15-25D封闭10min（封闭液：3%H O2 2溶于甲醇）光照紫外线导致包埋试剂的聚合（如:甲基丙尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂烯酸会导致样本DNA的断裂）在固定组织时样本DNA已断裂（内源核酸酶的确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定作用）固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA断裂用含有dUTP和dAPT的溶液封闭染色背景较高福尔马林固定导致某些含黑色素前体的细胞染尝试以甲醇固定，但可能会降低检测的敏感性。成黄色内源过氧化物酶未被封闭封闭液室温（15-25D
13、封闭10min（封闭液：3%H O22溶于甲醇）Biotin-dUTP的非特异性结合在TdT酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml BSA 的 PBS 洗三次。样本被支原体污染使用支原体检测试剂盒检测，如阳性则制备未被污染的新样本标记反应试剂（TdT酶及dUTP）的浓度过高 稀释50%，以降胝的标记反应的浓度细胞处于高度增殖期在非高增殖期取样检测DAB孵育时间过长减少DAB染色时间标记率低、染色如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定淡至无（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而或福尔马林或戊二醛固定。在操作中丢失）过度
14、的固定导致与蛋白过度交联缩短固定时间，或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定促渗条件不佳，以致于试剂不能到达靶分子或l增加通透剂促渗时间浓度过低l增加通透剂的作用温度（15-25C）l优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间（如：以400ug/ml 作用 5min）l 0.1M的柠檬酸钠70C作用30min。复染信号较弱选择的染料不合适阳性对照没有信号用溶于0.1M醋酸巴比妥的r3-5%甲基绿PH4.0,或 苏木素复染l冷冻切片使用3U/mlR的DNase Il石蜡切片使用1500U/ml的DNase Il 一般样本使用10U/ml DNase I/l 反应缓冲液：10mM Tris-HCl PH 7.9 10 mM NaCl, 5mMMnCl2, 10mM CaCl2 25mM KCl2 37C 反应 30 min, PBS洗去。组织样本从载玻组织样本被酶从玻片消化下来降低蛋白酶K的处理时间片脱落
