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1、第七章动物基因工程世界第一只转基因动物：转入生长激素基因的小鼠世界首只转基因灵长类动物一一安迪2001年1月11日，美国科学家宣布培育出了世界上首只转基因猴安迪”此项成果将为人类最终战胜糖尿病、乳腺癌、帕金森氏症和艾滋病等顽症提供帮助。在安迪”体内的是一种绿色荧光蛋白（GFP）标志基因。研究人员共对224只猴子的卵母细胞进行了转基因处理，接着对挑选出的40个转基因卵母细胞进行人工授精，然后把这40个受精卵分别植入20只代孕猴妈妈的子宫中，结果共有5只猴妈妈怀孕。但其中有三只小猴不幸夭折，还有一只未获成功，只有安迪”不仅产下后身体健康，而且转基因特征明显。转入荧光蛋白基因的兔子和鼠2000年，法
2、国科学家利用基因技术制造”出了一只可以发出绿色荧光的兔子“Alba。”应用了受精卵显微注射技术，从水母身上采集了荧光蛋白，基因改良后，使它的发光率比原先提高了两倍，再将该基因植入到了兔子的受精卵中，由此培养出了会发光的兔子Alba。第一节动物基因转移的选择标记一、嘌呤和嘧啶的生物合成嘌呤核苷酸生物合成途径从头合成途径5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP）AMP、GMP补救合成途径：次黄嘌呤核苷（HR）次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP）AMP、GMP嘧啶核苷酸生物合成途径从头合成途径尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）补救合成途径胸腺嘧啶核苷（TR）补救合成
3、途径胸腺嘧啶核苷（TR）胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）二、胸腺激酶基因选择系统选择TK+细胞的培养基含有次黄嘌呤（hypoxanthine）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸苷（thymidne），所以叫做HAT选择法。基本原理是，如果用叶酸的类似物氨基蝶呤（APT）处理细胞，二氢叶酸还原酶便被抑制，培养基中的还原辅助因子四氢叶酸因得不到补充而逐渐耗尽，于是从dUMP合成dTTP，以及dATP和dGTP的重新合成便因此被阻断。但次黄嘌呤是dATP和dGTP补救合成途径的一种底物，培养基中补加有此种物质时，细胞能逾越氨基蝶呤的抑制作用，继续合成出这些脱氧嘌呤三磷酸（dATP和dGTP）。同时
4、，由于在HAT培养基中补加有外源的胸苷，所以TK+细胞通过胸苷激酶的作用可把它合成为dTTP，继续存活下去；而TK细胞则不会发生这种合成，因而死亡。含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk-）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补含有次黄嘌呤磷酸转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞（hprt-）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因hprt与之遗传互补哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记氨基糖苷磷酸转移酶二氢叶酸还原酶潮霉素B磷酸转移酶胸甘激酶基因
5、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶腺苷脱氨酶第二节病毒载体实验证明，一些真核生物的病毒，经过改建之后，都可以发展成为用于转移动物基因的分子载体。这主要是由于动物病毒具有如下的特点： 动物病毒含有能够被真核细胞识别的有效的启动子。 有许多种动物病毒，在其感染周期中都能够持续地复制，使其基因组拷贝数达到相当高的水平。 有些动物病毒具有控制自己复制的顺式元件和反式作用因子。 有些动物病毒，在它们的复制过程中能高效稳定地整合到寄主核基因组上。 病毒的外壳蛋白质能够识别细胞接受器。用病毒外壳蛋白质包装重组质粒DNA形成的假病毒颗粒，即构成了一种高效的转化体系。一、SV40病毒载体猿猴空泡病毒40(Simianv
6、acuolatingvirus40,SV40)是迄今为止研究得最为详尽的乳多空病毒(Papovaviruses)之一。SV40病毒的基因组是一种环形双链的DNA，其大小仅有5243bp,很适于基因操作。1.SV40病毒的基本生物学特性SV40病毒是一种小型的20面体的蛋白质颗粒，由三种病毒外壳蛋白质Vp1、Vp2和Vp3构成，中间包装着一条环形的病毒基因组DNA。同其它病毒不同，SV40DNA是同除了H1之外的所有寄主细胞组蛋白(H4、H2a、H2b和H3)相结合。这些组蛋白使病毒DNA分子紧缩成真核染色质所特有的念珠状核小体，这种结构特称为微型染色体(minichromosome)。感染之后
7、的SV40基因组，输送到细胞核内进行转录和复制。SV40病毒基因组表达的时间顺序是相当严格的,据此可将其区分为早期表达区和晚期表达区。图2.SV40病毒载体野生型的SV40病毒颗粒的包装范围相当严格，超过其基因组大小(5.2kb)的重组DNA就不能够被包装为成熟的病毒颗粒。而且，SV40还存在着寄主细胞的局限性，它只能在受体细胞中增殖，并最终导致寄主细胞的死亡，这样就不能作长期的培养使用。因此，野生型的SV40病毒必须经过改造之后，才能发展成为基因克隆的有用载体。目前设计的以SV40为基础的基因克隆载体，主要有两种不同的类型：取代型的重组病毒载体；重组的病毒-质粒载体取代型的重组病毒载体。外源
8、DNA是直接插入在缺陷性的病毒基因组上。由于插入的外源DNA片段，在大小上同被取代的病毒基因组区段是等同的，因此形成的重组体DNA能够在哺乳动物的受体细胞中增殖，并被包装成病毒颗粒。但为了补充这段被取代的病毒基因组DNA的功能，必须使用一种与之互补的辅助病毒。 晚期区段取代载体实验中已经观察到，缺失了整个晚期区段功能的SV40病毒，同可互补这段功能的一种温度敏感(ts)的辅助病毒混合感染时，仍然能够增殖。因此，可以通过取代晚期区段的途径构建SV40病毒载体。最常用的辅助病毒是tsA突变体，它合成一种温度敏感的T抗原。图早期区段取代载体按照同样的道理，也可以构建出早期区段取代载体。当SV40病毒
9、的早期区段被取代后，就失去了T抗原的功能，因此，早期区段取代载体必须使用具有互补功能的辅助病毒。这自然显得比较麻烦。1981年Y.Gluzman发现了一种特殊的COS细胞系，能够有效地互补T抗原，从而大大地方便了早期区段取代载体的使用，被认为是SV40载体发展历程中的一个重要的突破。(1) 重组的病毒-质粒载体第二种是重组的病毒-质粒载体。在这类载体中，病毒基因组部分只保留下维持在哺乳动物细胞中进行复制所必须的有关序列，但它融合上了一个细菌质粒，因而还能够在大肠杆菌细胞中进行复制和增殖。不过这种重组体分子没有被包装成病毒颗粒，不会出现裂解感染的情况，它实际上是一种类似于质粒的DNA分子载体。含
10、有完整早期区段和复制起点的病毒-质粒载体SV40和多瘤病毒(polyomavirus)的基因组能够在寄主细胞中快速地复制，并达到相当高的拷贝数。利用这种能力，现在已经发展出了一类特殊的病毒载体。这类病毒载体，实质上是由病毒的早期区段和复制起点同大肠杆菌的质粒分子重组而成的，所以又叫做病毒-质粒载体(viral-plasmidvector)。由于它们既可在大肠杆菌细胞中复制，也能在哺乳动物细胞中复制，根据这种特性，在有的文献中有时也称之为穿梭载体。图：病毒-质粒载体paC10就是一种典型的穿梭载体，其中的早期区段和复制起点来自多瘤病毒，质粒是大肠杆菌的pBR322，克隆的外源DNA是小鼠免疫珠蛋
11、白重链基因。微型病毒复制子-质粒载体实验发现，在COS或HFS细胞中，含有SV40DNA复制起点的任何大小的环形DNA，都能够像质粒一样进行独立的复制。根据这种原理，许多实验室都把只含有SV40复制起点的DNA片段，即所谓的微型病毒复制子(mini-viralreplicon)，插入在大肠杆菌的质粒载体上，构成了一种新型的病毒-质粒载体，称为微型病毒复制子-质粒载体。图：pTBC-1就是一种典型的SV40微型病毒复制子-质粒载体，如果将这种载体导入COS或HFS细胞，它们就能利用细胞提供的T抗原复制出非常大量的拷贝数。所以可以用来高水平地表达外源蛋白质。二、反转录病毒载体反转录病毒(retro
12、viruses)是一类含单链RNA的动物病毒。它的基因组含有2条相同的正链RNA分子，包装成二倍体病毒颗粒。迄今已经在鸟类及哺乳类动物中发现了许多种反转录病毒，例如鸟类的脾坏死病毒(SNV)、鼠类的乳腺肿瘤病毒(MMTV)等等，但其中研究得最为详尽的则要数劳斯肉瘤病毒(Roussarcomavirus，RSV)。RSV病毒感染了鸡之后，就会诱发产生肿瘤。从感染细胞中分离出来的反转录病毒的DNA，是一种有用的动物细胞的基因载体。反转录病毒具有许多优点，便于发展作为动物基因克隆载体。第一，在大多数情况下，反转录病毒的肿瘤基因(oncogene,one)都能够在正常的细胞中转录。第二,反转录病毒的寄
13、主范围相当广泛,包括无脊椎动物和脊椎动物。第三，反转录病毒具有强启动子，克隆此类载体上的外源基因有可能得到有效的表达。第四，反转录病毒不但感染效率高，而且通常还不会招致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和形成感染性病毒颗粒的能力。1.反转录病毒的生命周期一种典型的反转录病毒的生命周期，是从它的感染颗粒同寄主细胞表面待定的接受器结合，并进入细胞的时候开始的。整个周期可以分为两个时期。在第一时期，首先是在细胞质中的病毒颗粒脱掉蛋白质外壳，释放出的()RNA在反转录酶作用下，合成()DNA。()RNA链通过反转录酶加工作用，被逐渐地降解掉。剩下的()DNA继续指
14、导反转录酶合成()DNA。最终形成的双链形式的DNA分子整合到寄主细胞的染色体基因组上，成为原病毒(provirus)。在双链形式的DNA进入寄主细胞核成为原病毒之后，便开始了反转录病毒生命周期的第二时相。此时，原病毒DNA进行活跃的转录，合成出来的转录本被加工成mRNA，进而转译为2种成品蛋白质(finishedproteins)和2种聚合蛋白质(polyproteins)。病毒颗粒是在细胞质中组装的，成熟后即通过出芽(budding)的形式从感染细胞中挤压出去，而细胞本身并没有任何损伤，因此可以长时间持续地释放病毒颗粒。图：反转录病毒的生命周期2.反转录病毒载体辅助病毒互补的反转录病毒质粒
15、载体(1) 不需要辅助病毒互补的反转录病毒质粒载广寄主的反转录病毒载体(2) 反转录病毒表达载体三、痘苗病毒载体痘苗病毒(Vacciniavirus)具有双链DNA基因组，同天花的病原体天花病毒(Variolavirus)的亲缘关系十分密切。当人们接种了痘苗病毒之后，便可获得对天花的高度免疫性。在DNA重组技术发展之后不久，就有人将外源DNA片段插入到痘苗病毒的基因组中，得到了具有生物活性的重组病毒。根据这一发现，基因工程学家便设想构建能够表达多种病原体抗原的重组痘苗病毒，作为预防这些病原体感染的活疫苗。(1) 痘苗病毒的特性痘苗病毒是在细胞质中进行复制和转录的的，因此自身需要编码为这些表达活
16、性所需要的全部蛋白酶。由于痘苗病毒拥有广泛的寄主范围，而且其基因组至少能够容纳25kb大小的外源DNA片段的插入，具有相当大的克隆能力。这些优点，又使痘苗病毒具备了发展作为动物基因克隆载体的良好的条件。然而由于痘苗病毒基因组DNA是非感染性的，故不能直接用于感染寄主细胞。(2) 痘苗病毒载体的构建痘苗病毒载体pGS20为例，首先将编码着tk基因的痘苗病毒基因组DNA之HindIII-J片段，克隆到大肠杆菌质粒载体pBR328分子上；然后再把含有另一种痘苗病毒基因的启动子(p7.5)和转录起点的275bpDNA区段，插入到tk基因序列中间，于是便构成了痘苗病毒质粒载体pGS20应用pGS20痘苗病毒质粒载体，已成功地在猿猴细胞中表达乙型肝炎病毒表面抗原HbsAg，和流
