《表达载体的构建方法及步骤》由会员分享，可在线阅读，更多相关《表达载体的构建方法及步骤（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、For personal use only in study and research; not for commercial use表 达 载 体 的 构 建 方 法 及 步 骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类，其中质粒DNA是一种新的非病毒转基 因载体。一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段（4）P/E启动子/增强子（5）Terms终止信号（6
2、）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如 果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表 达载体。【2】.载体的类型:(1) 克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小(大选大，小选小)。如10kb选 质粒。(2) 表达载体据受体细胞类型-原核/真核/穿梭，E.coli哺乳类细胞表达载体。(3) 对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达 真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位;表达天然蛋白
3、质或融合蛋白作为 相应载体的参考。【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与 载体易于链接，不能产生阅读框架错位。综上所述，选用质粒(最常用)做载体的5点要求：(1) 选分子量小的质粒，即小载体(1-1.5kb)-不易损坏，在细菌里面拷贝 数也多(也有大载体);(2) 一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而 严谨型质粒10个。(3) 必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；(4) 必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr (试一 试)。(5) 满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否 需要加入标
4、签蛋白，是否需要真核抗性(如Puro、G418 )等等。无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体 DNA进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。(1) Ampr水解。-内酰胺环，解除氨苄的毒性。(2) tetr可以阻止四环素进入细胞。(3) camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。(4) neor (kanr)氨基糖苷磷酸转移酶使G418 (长那霉素衍生物)失活(5) hygr使潮霉素底活。第三步：看多克隆位
5、点(MCS )。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基 因的插入。如果在这些酶切位点以外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的 失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源 DNA 片段。一般来说，外源DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率 越低。第五步：是否含有表达系统元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录 终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控 有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。第六步：启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终
6、止信号(1) 启动子-促进DNA 转录的DNA 序列，这个DNA 区域常在基因或操 纵子编码序列的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始 转录的部位，但启动子本身不被转录。(2) 增强子/沉默子-为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强 邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所 调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子-负增强子，负调控序列。(3) 核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs ): mRNA 有核糖 体的两个结合位点，对于原核而言是AUG (起始密码)和SD序列。(4) 转录终止序列(终止子)/翻译终止
7、密码子：结构基因的最后一个外显子中 有一个AATAAA 的保守序列，此位点down -stream有一段GT或T富丰 区，这2部分共同构成poly (A )加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有 一个AATAAA 的保守序列，此位点down -stream有一段GT或T富丰区， 这2部分共同构成poly (A )加尾信号。质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA 链，即 质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一 条链上.根据表达宿主不同，构建时所选择的载体也会不同。二、目的基因的获得一般来说，目的基因的获得有三种途径：调取基因:根据目的基因的
8、序列，设计引物从含有目的基因的cDNA中通过PCR 的方法调取目的基因，链接到克隆载体挑取单克隆进行测序，以获得想要的基因 片段，这种方法相对成本较低，但是调取到的基因往往含有突变，还有不同基因 的表达丰度不同，转录本比较复杂，或是基因片段很长，这些情)兄都很难调取到 目的基因。全基因合成：根据目的基因的DNA序列，直接设计合成目的基因。此方法准确 性高，相对成本会高一些，个人操作比较困难，需要专业的合成公司完成。优点 是可以合成难调取及人工改造的任何基因序列，同时可以进行密码子优化，提高 目的基因在宿主内的表达量。三、克隆构建目前，克隆构建的方法多种多样，除了应用广泛的酶切链接以外，现在还有
9、很多 不依赖酶切位点的克隆构建方式。下面具体说一下双酶切方法构建载体的步骤。 实验材料实验试剂试剂名称生产厂家载体 pCDNA3.1Transheep大肠杆菌菌株DH5 aTiangen限制性内切酶FermentasT4 连接酶Fermentas 质粒DNA小，大量抽提试剂盒Axygen凝胶回收试剂盒Axygen琼脂糖BiowestDNA ladderFermentas(2) X基因慢病毒载体的构建X基因基因由Transheep全基因合成，构建于载体PUC57中。PUC57-X 基因 EcoRI/BamHI 酶切结果:酶切完成后进行胶回收2.载体用PCDNA3.1双酶切，酶切体系如下。20ul
10、酶切体系37度3小时4ul pCDNA3.1 载体(500 ng/ul)1ul BamHI1ul EcoRI2ul 10xbuffer12 ul H2O酶切完成后胶回收(见附录)处理好的目的片段与载体连接反应体系：6ul PCR酶切回收片段（约50ng/ul ）1ul酶切好的载体（约50ng/ul）2ul ligase buffer1ul T4ligase10ul H2O以上连接液在16C过夜。转化 感受态细胞：DH5a）,具体步骤见附录转化部分。抗性：Amp; 37C，培养过夜转化后X基因分别平板挑菌，370 250转/分钟摇菌14小时，PCR鉴定后，将 阳性菌液送上海权阳生物技术有限公司测序。X基因慢病毒载体单克隆菌落PCR鉴定（使用载体通用引物,PCR条带大小应比 实际大200bp左右）
