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1、word海 南 大 学毕 业 论 文设计题 目：瓜实蝇致病菌粘质沙雷氏菌的别离与鉴定 学 号：姓 名： 路 冰 斌 年 级：2010 级 学 院： 环境与植物保护学院 系 别： 植物保护 专 业： 植物保护农药方向 指导教师： 杨叶教授 完成日期： 2014 年 5 月 1 日 / 摘要从瓜实蝇虫尸上别离出的一株产紫红色色素的细菌BC-hn212，染病死亡后的瓜实蝇成虫腹部明显发红。采用形态学、生理生化方法对其进展初步鉴定；并提取基因组DNA，16SrDNA基因序列分析。该菌株菌落圆形隆起，光滑粘稠，有轻微异味；24h后菌落颜色加深、气味变为恶臭，显微镜下观察为球形或杆状菌；革兰氏染色阴性，甲
2、基红为阳性，V.P阳性，淀粉水解实验阳性，果聚糖形成阴性，H2S产生阴性，明胶水解阳性，过氧化氢酶阳性，氧化酶阴性。根据形态学于生理生化方法的鉴定结果初步判定为沙雷氏菌属。根据16SrDNA基因序列分析结果，可以确定此株菌株为粘质沙雷氏菌。本实验初步证明粘质沙雷氏菌对于瓜实蝇具有较强致病能力，为进一步研究粘质沙雷氏菌对于昆虫存在致病性提供依据。关键词：瓜实蝇；粘质沙雷氏菌；别离与鉴定AbstractAstrainisolatedfromthepurplepigmentbacteria (2-1-1), afterexpandingtrainingforhealthmelonfly3to5day
3、safterdyingbacteria, melonflyabdominalbecameredandmelonflydied. Thentoisolatethebacteria, themorphological, physiologicalandbiochemicalmethodcarriesonthepreliminaryappraisal; ExtractionofgenomicDNA, using16srRNAuniversalprimers, PCRamplificationof16srDNAgenefragments, throughmultiplesequencealignmen
4、tandhomologyanalysis, constructingphylogenetictrees, serratiabacteriahasthehighesthomology.Thecircularupliftmutantsweresmoothviscousandslightodor; After24hthecolonycolordeepened, anditsmelllikeamess.UsingMicroscopetoobserve, itlookedsphericalorrod-shapedbacteria.Gramwasnegative, andmethylredwasposit
5、ive,andValerieplamewaspositive, andstarchhydrolysisexperimentsispositive, andfructanformationwasnegative,andH2Sproducednegative, andgelatinhydrolysatewaspositive, andcatalasewaspositive, andoxidasewasnegative. Accordingtotheresultofmorphologyinidentificationofphysiologicalandbiochemicalmethods, wede
6、termineinitialserratia. Thenweuse16SrDNAgenesequenceanalysis,. Accordingtotheparedresults, wecertainthatthisstrainofbacteriaisserratiamarcescens.Theexperimentpreliminaryprovesthatserratiamarcescenshasstrongabilityofpathogenicformelonfly, forthefurtherstudyofserratiamarcescens, itprovidesevidencetopr
7、ovethatserratiamarcescensarepathogenic.Keywords：Serratiamarcescens;Bactrocera，cucuribitae;Isolationandidentification目 录1 前言.11.1 瓜实蝇为害的根本情况.11.2 瓜实蝇的防治现状.12 材料与方法.22.1 供试材料.22.1.1 菌株来源.22.1.2 培养基.22.1.3 生化试剂.32.2 主要仪器与设备.32.3 实验方法. .32.3.1菌种别离纯化和筛选. .32.3.2致病性测定.32.3.3菌种鉴定.43 实验结果.43.1致病菌株的别离与致病性测定.
8、43.2 BC-hn212菌株的鉴定.53.2.1 形态特征.53.2.2 生理生化特征.53.2.3 分子生物鉴定学.74 结果与讨论.9致谢.10参考文献.11附录.121 前言1.1瓜实蝇为害的根本情况瓜实蝇Baetroceraeu curbitae(Coquillett)，英文名为melonfiy，俗称为黄蜂子和针蜂，是双翅目Diptera，实蝇科Tephritidae的害虫。文献记载,瓜实蝇最早发现于印度的马来亚地区,至今己广泛分布在热带、亚热带和温带的30多个国家和地区。我国瓜实蝇发生的省区有某某、某某、某某、某某、某某、某某、某某、某某、某某、某某等1。近年来，随着蔬菜种植面积的
9、逐年扩大,全年栽培的瓜果类蔬菜和水果类的品种繁多，各品种的成熟期不一致等，为瓜实蝇的种群生长发育提供了丰富的食料，使得瓜实蝇的危害也在逐年加重，己对我国南方地区的蔬菜种植与生产构成了较大的潜在威胁2。瓜实蝇对作物的为害主要是雌性成虫产卵于果蔬类蔬菜的花和幼嫩瓜果的组织内，幼虫孵化后即在花或果肉内取食，使花果腐烂,引起大量的花果脱落3；受害后的果实即使不腐烂脱落，受刺伤处会有流胶凝结，使果实不能正常生长，变畸形，果皮变硬，风味苦涩，品质差，不能食用等；不仅使经济蒙受了巨大的损失，而且还给果蔬类蔬菜的对外贸易和开展带来了极其严重的影响4。受瓜实蝇为害的瓜果损失程度一般在30%至100%之间。其中，
10、又以苦瓜的受害最为严重,，损失平均产量的50%，严重时可达100%。1.2瓜实蝇的防治近几年来，瓜实蝇对瓜果的危害越来越重，常用的化学药剂防治效果并不理想，特别是有机磷农药的大量使用，使瓜实蝇抗性严重，且残留问题也难以得到解决，对人体健康造成较大危害。而毒饵和诱捕器诱杀，受天气影响大，本钱高，操作繁琐，并不能得到普与。另外也有报道利用从土壤中别离出的绿僵菌Metarkizium anisopliae、球孢白僵菌Beauveria bassiana防治瓜实蝇，防治效果高达90%。微生物杀虫主要是利用昆虫病原微生物感染寄生虫使其发病而达到防治的目的。微生物繁殖快、生产原料广、方法简便；在环境中存活
11、力强，可以长期压低虫口密度；不易使害虫产生抗药性；对人、畜、作物和自然环境安全无害。目前微生物防治昆虫的研究大多在于真菌上比如白僵菌、绿僵菌等，而在细菌上研究相对较少。本实验别离出的细菌菌株BC-hn212对瓜实蝇有很高的致死率。2材料与方法2.1供试材料2.1.1菌株来源瓜实蝇致病菌粘质沙雷氏菌从自然感病死亡的瓜实蝇虫尸别离获得，编号：BC-hn212。2.1.2培养基1PDA培养基：马铃薯 200g，葡萄糖 20g，琼脂 20g，加水补至1000mL。2LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂 20g/L，pH7.07.2，用去离子水定容至1L，高压灭菌121，20min。3液体LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，pH7.07.2.用去离子水定容至1L，分装后高压灭菌121，20min。4淀粉水解培养基：肉汤
