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1、硕士学位论文基于二氧化硅纳米颗粒的抗肿瘤药物载体研究A Novel Anticancer Drug Carrier System Based on Silica NanoparticlesbyHAI LuoB.S. (Hunan University) 2007A thesis submitted in partial satisfaction of the Requirements for the degree ofMaster of ScienceinBiochemistry and molecular biologyin theGraduate SchoolofHunan Univers
2、itySupervisorProfessor He Xiaoxiao & Professor Wang Kemin June, 2010硕士学位论文湖 南 大 学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名： 日期：2010年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构
3、送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密，在_年解密后适用本授权书。2、不保密R。（请在以上相应方框内打“P”）作者签名： 日期：2010年 月 日导师签名： 日期：2010年 月 日摘 要癌症治疗对于提高患者的生存质量、减轻患者的痛苦、降低死亡率具有十分重要的意义。传统的化疗方法存在毒副作用大等缺点，对患者身心造成极大地损伤。随着纳米技术的迅速发展，功能化纳米材料作为一种新型抗肿瘤药物载体为癌症治疗注入了新的活力，为改善抗肿瘤药物载药体
4、系提供了新的思路与手段。二氧化硅纳米颗粒材料作为无机纳米颗粒材料的重要成员之一，由于其制备简便、性质稳定、生物相容性好和表面易修饰，在生物医学领域发挥了重要作用。本论文瞄准抗肿瘤药物载体这一前沿研究方向，在对各种抗肿瘤药物载体进行简要综述的基础上，以二氧化硅纳米颗粒用于抗肿瘤药物载体为主线，主要开展了以下三个方面的工作：一、基于磷酸化修饰的二氧化硅纳米颗粒药物缓释载体研究采用反相微乳液体系中功能化基团同步修饰方法制备了包载抗肿瘤药物平阳霉素的磷酸化二氧化硅纳米颗粒（PO4-PYM-SiNP），考查了不同量磷酸化修饰试剂对PO4-PYM-SiNP的影响。结果表明：随着磷酸化修饰试剂量的增加，制备
5、的PO4-PYM-SiNP的电位逐渐降低，其包载的平阳霉素的释放速率逐渐加快，但磷酸化修饰量的不同对颗粒的粒径没有明显影响。选择能使药物平稳、缓慢释放的磷酸化修饰试剂量，制备了稳定性好、药物缓释时间长的PO4-PYM-SiNP，其载药量和包封率分别为7.2%和37.81%，通过与CNE-2细胞共培育后，可以使CNE-2细胞的存活率逐渐下降，而磷酸化二氧化硅纳米颗粒PO4-SiNP载体本身是没有毒性。这一研究工作的开展拓展了二氧化硅纳米颗粒在药物载体领域的应用。二、基于氟化钠催化的包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒的制备研究采用反相微乳液法以氟化钠为催化剂，制备包载阿霉素的二氧化硅纳米颗粒（DOX-Si
6、NP），优化了阿霉素的最佳包裹浓度，并通过采用不同硅烷化试剂制备了不同功能化基团修饰包载阿霉素的二氧化硅纳米颗粒，包括氨基化包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒(NH2-DOX-SiNP)、聚乙二醇化包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒(PEG-DOX-SiNP)、磷酸化包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒(PO4-DOX-SiNP)和羧基化包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒(COOH-DOX-SiNP)，考察了这些颗粒的药物缓释性能。在此基础上，为便于后续功能生物分子的修饰，再具体以COOH-DOX-SiNP为研究对象，优化了羧基化硅烷化试剂的最佳修饰量。结果表明：通过采用氟化钠为催化剂，能将在强酸及碱性条件下不稳定的抗肿瘤药物
7、阿霉素包裹进二氧化硅纳米颗粒中获得阿霉素二氧化硅纳米颗粒。当采用不同硅烷化试剂修饰获得不同功能化基团修饰包载阿霉素的二氧化硅纳米颗粒，其药物释放平稳且缓释时间长。通过优化阿霉素浓度和羧基化硅烷化试剂的最佳修饰量制备得到的COOH-DOX-SiNP荧光强度高、尺寸均一、形状规则、分散性好，稳定性高，载药量和包封率分别为4.2%和21.98%。该研究工作的开展为将在强酸及碱性条件下不稳定的分子包裹进二氧化硅纳米颗粒内提供了一种新的方法。三、核酸适体功能化包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒用于肿瘤靶向治疗研究通过EDC/NHS交联方法，将CCRF-CEM细胞（人急性白血病T淋巴细胞）特异性核酸适体Sgc8c
8、修饰在羧基化二氧化硅纳米颗粒（COOH-DOX-SiNP）表面，获得Sgc8c修饰的二氧化硅纳米颗粒（Sgc8c-DOX-SiNP）。在此基础上，采用MTT法和碘化丙啶染色法考察了氟化钠催化方法制备的二氧化硅纳米颗粒(COOH-SiNP)、未修饰Sgc8c的阿霉素二氧化硅纳米颗粒(COOH-DOX-SiNP)以及Sgc8c-DOX-SiNP对肿瘤细胞的杀伤效果。结果表明：在一定浓度范围内，COOH-SiNP载体本身没有毒性。当将阿霉素载入COOH-SiNP后，获得的COOH-DOX-SiNP对CCRF-CEM细胞和Ramos细胞均具有很好的杀伤效果，并且对CCRF-CEM细胞和Ramos细胞具
9、有无选择的杀伤。对CEM细胞来说，其半致死浓度相对未包裹的阿霉素提高了5.46倍。修饰了靶向分子以后，Sgc8c-DOX-SiNP则能够选择性地杀伤靶细胞CCRF-CEM，而对非靶向的Ramos细胞的存活率影响则较小。这是因为修饰了核酸适体的载药颗粒能够特异性识别靶细胞。通过利用阿霉素自身的荧光信号，采用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜考察Sgc8c-DOX-SiNP对靶细胞的识别效果更进一步证实了这一解释。这一研究工作首次将核酸适体连接到阿霉素二氧化硅纳米颗粒表面实现了抗肿瘤药物的靶向运输与治疗。关键词：抗肿瘤药物；核酸适体；药物载体；二氧化硅纳米颗粒；氟化钠；阿霉素；平阳霉素AbstractC
10、ancer therapy can alleviate the suffering, improve quality of life and reduce mortality of patients.Traditional chemotherapy exists side effects and cause greatly physical and psychological damage to the patients. Recently, nanotechnology constantly influence antitumor drugs delivery field and trigg
11、ered a profound revolution. Silica nanoparticles, as one of the important inorganic nanomaterials, display several features of straightforward synthesis, good stability, excellent biocompatibility and easily modification, which make them be widely applied in biomedicine. Aiming at the important aspe
12、ct of anticancer drug delivery, this thesis mainly focuses on development of a novel anticancer drug carrier system based on silica nanoparticles. The three parts of the thesis are as follows.1. Study on a novel drug carrier system based on phosphonate-terminated silica nanoparticles.Pingyangmycin (
13、PYM) doped phosphonate-terminated silica nanoparticles (PO4-PYM-SiNP) were prepared via the synchronous modification of functional group in the water-in-oil microemulsion. The effect of 3-trihydroxysilylpropyl methylphosphonate (THPMP) on the PO4-PYM-SiNP has been investigated. The results showed th
14、at the zeta potential of PO4-PYM-SiNP decreased obviously, and the release rate of PYM from the PO4-PYM-SiNP accelerated with increase of added THPMP. However, the quantum of THPMP had no impact on the size of PO4-PYM-SiNP. A PO4-PYM-SiNP with good stability and long acting release has been prepared
15、 using optimal quantum THPMP, at which the drug can release steadily and slowly. The prepared PO4-PYM-SiNP presented drug loading and entrapment efficiency of 7.2% and 37.81%, respectively. The PO4-PYM-SiNP could make the survival rate of CNE-2 cells fell gradually, and PO4-SiNP itself was nontoxic.
16、 The research work expands the applications of silica nanoparticles in the field of drug carrier.2. Study on NaF-Catalyzed Synthesis of Doxorubicin Doped Silica NanoparticlesWe used sodium fluoride (NaF) catalyzed hydrolysis of silane precursors in the reverse microemulsion to encapsulate doxorubicin (DOX)
