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1、实时荧光定量PCR具体实验步骤Document number【AA80KGB-AA98YT-AAT8CB-2A6UT-A18GG】实时荧光定PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1样品RNA的抽提 取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。 手动剧烈振荡管体15秒后，15到30C孵育2到3分钟。4C下12000rpm离心 15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上 层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试 剂的60%。 RNA沉淀将水相上层转移到一
2、干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混 合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30C孵育10分钟后，于4C下12000rpm离 心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀 块。 RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙 醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4C下7000rpm离心5 分钟。 RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分 钟。 溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40 口 l用枪反复吹打几次， 使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80C待用。2
3、RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释 （1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。 浓度测定A260下读值为1表示40 口 gRNA/ml。样品RNA浓度（口 g/ml）计算公式为：A260 X稀释倍数X40u g/ml。具体计算如下：RNA溶于40 口 lDEPC水中，取5ul，1:100稀释至495 口 l的TE中，测得 A260=0.21RNA 浓度=0.21X 100 X40 口 g/ml=840 口 g/ml 或 0.84 口 g/ 口 l取5ul用来测量以后，剩余样
4、品RNA为35 口 l,剩余RNA总量为：35ulX0.84ug/u l=29.4 口 g 纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60C，10ml的10XMOPS电泳缓冲液和18ml 的37%甲醛溶液（12.3 M）。10XMOPS电泳缓冲液浓度成分0.4MMOPS，pH7.00.1M 乙酸钠0.01MEDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 l溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶 板放入电泳槽内，加足量的1XMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。 准备 RNA 样品取3 口 gRNA
5、，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为 10 口 g/ml。加热至70C孵育15分钟使样品变性。 电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5 - 6V/cm电压下2h，电 泳至溴酚兰指示剂进胶至少2 -3cm。 紫外透射光下观察并拍照28S 和 18S 核糖体 RNA 的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提 RNA 的物种类 型），上面一条带的密度大约是下面一条带的 2 倍。还有可能观察到一个更小 稍微扩散的带，它由低分子量的RNA （tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S 核糖体带之间可以看到一片弥散的 EB 染色物质，可能是由 mRNA 和其它
6、异 型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的 上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA 带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3 样品 cDNA 合成 反应体系 序号反应物剂量1 逆转录 buffer2 口 l2上游引物0.2 口 l3下游引物0.2 口 l4dNTP0.1 口 l5逆转录酶MMLV0.5 口 l6DEPC 水 5 口 l7RNA 模版 2 口 l8总体积10 口 l轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70C干浴3分钟，取出后立即冰水浴至 管内外温度一致，然后加逆转
7、录酶0.5 口 l, 37C水浴60分钟。 取出后立即95C干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于- 80C待用。4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（B-actin）实时定量PCR B-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011，反应前取3 口 l 按10倍稀释（加水27 口 l并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、 106、105、104，以备用。 反应体系如下： 标准品反应体系 序号反应物剂量 1SYBRGreen1 染料 10 口 l2阳性模板上游引物F0.5口l3阳性模板下游引物R0.5口l4dNTP0.5 口 l5Taq 酶 1口
8、l6阳性模板DNA5 口 l7ddH O32.5 口 l8总体积50 口 l 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。管家基因反应体系： 序号反应物剂量lSYBRGreenl 染料 10 口 l2内参照上游引物F0.5口l3内参照下游引物R0.5口l4dNTP0.5 口 l5Taq 酶 1口 l6待测样品CDNA5 口 l7ddH O32.5 口 l8总体积50 口 l 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93C 2分钟，然 后93C1分钟，55C2分钟，共40个循环。5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板 针对每一需要测量的
9、基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反 应。反应体系： 序号反应物剂量110XPCR 缓冲液 2.5ul2MgCl 溶液 1.5ul23 上游引物 F0.5ul4 下游引物 R0.5ul5dNTP 混合液 3ul6Taq 聚合酶 1ul7cDNA1ul8 加水至总体积为 25ul 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环（94C1分钟；55C1分钟；72C1分钟）；72oC延伸5分钟。 PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物 是否为单一特异性扩增条带。 将PCR产物进行10倍梯度稀释:将PCR产物进行10倍梯度稀释:设
10、定PCR产 物浓度为1X1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。6待测样品的待测基因实时定量 PCR所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。 体系配置如下：序号反应物剂量1SYBRGreen1 染料 10ul2 上游引物 1ul3 下游引物 1ul4dNTP1ul5Taq 聚合酶 2ul6 待测样品 cDNA5ul7ddH2O30ul8 总体积 50ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。反应条 件为：93C2分钟预变性，然后按93C 1分钟，55C 1分钟，72C
11、 1分钟，共40 做个循环，最后72C7分钟延伸。7 实时定量 PCR 使用引物列表引物设计软件：PrimerPremier5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密 互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非 目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。8 电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行RealtimePCR反应。PCR产物与 DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一 特异性扩增条带。实时荧光定量PCR组织RNA提取：一般认为100mg肝组织提取RNA500ng，100mg肺提取RNA200ng，脑内的RNA 丰度适
12、中，100mg脑组织，提取RNA5-200ng。所以一个10mg的海马可匀出RNA约 为20ng。反转录反应反转录反应参照TaKaRaRT-PCR说明书。反转录反应条件如下。37 C15min （反转录反应）85 C5sec （反转录酶的失活反应）RealTimePCR 反应选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18SrRNA（18SrRNA）做 为内参。基因引物序列扩增片段长 度NR2BNR2B(+)CCGCAGCACTATTGAGAACA213bpNR2B(-)ATCCATGTGTAGCCGTAGCC18srRNA18srRNA(+)TTTGTTGGTTTTCGGAACTGA1
13、98bp18srRNA(- )CGTTTATGGTCGGAACTACGA1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量终浓度SYBRPremixExTaqTM(2X)12.5U11XPCRForwardPrimer (10uM)1口10.4口MPCRReversePrimer (10uM)1口10.4口M模板（cDNA溶液）0.5口1dH2O10口1Total25 口 1全班40人，分为5组，每组做8管。4管做BDNF, 4管做18SrRNA。4管BDNF或者 18SrRNA，采用相应的正反PCR引物。每种基因做两个模板，一个模板采用原液 浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，
14、体积均为0.5口1。2）三步法PCR首先95 C作用3min。PCR 进行 35 个循环。步骤温度时间变性95 C30秒退火58C30 秒延伸72 C30秒融解曲线温度时间变温速度95 C0秒20 C/秒55C15秒20 C/秒95 C0秒0.1 C/秒PCR疑难解答当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：1 将 PCR 反应的试管与反应板紧贴。2当酶反应混合物以70C “热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍3微振荡 一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。4 不要随意减少 dNTP 的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平 衡。5 对于有问题的 PCR 反应，
15、例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试 加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。没有扩增产物：1在提供MgC12缓冲液中，以0.25mmo1/L为梯度增加MgC12浓度；无MgC12的 缓冲液以0.5mmo1/L为梯度增加MgC12浓度。2泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加 MgC12，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。3 检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。4 检查模板和引物的用量。5增加循环次数和/或模板DNA的用量。泳道中出现模糊条带：1 减少循环次数或模板 DNA 的用量。2提高退火温度，但不要超过68C。3重新设计引物或设计更长的引物。 其他值得注意的条件：1建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92C时
