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1、附件 11：化妆品中苯甲酸及其盐的检测方法高效液相色谱法1 范围 本方法规定了采用高效液相色谱法测定化妆品中防腐剂苯甲酸（ CAS：65-85-0 及其钠盐（以苯甲酸计）含量的方法。本方法适用于膏霜、乳、液、粉类化妆品中苯甲酸及其钠盐的测定。 暂无实验数据表明本方法适用于蜡质类化妆品中苯甲酸及其钠盐含量的测定。2方法提要 试样经酸化后，用乙醇和水的混合溶液，经水浴、超声提取，采用高效液相色 谱仪分离，紫外检测器检测，根据保留时间定性，峰面积定量，以标准曲线法计算含量。本方法的检出限为0.000225|jg,定量下限为0.00075旧。若取1.0g样品，本方法对苯甲酸的检出浓度为 0.0001%
2、；最低定量浓度为 0.0004%。必要时，采用气相色谱-质谱（GC/MS）确证。3 试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯,水为超纯水。3.1 无水乙醇。3.2 磷酸二氢钠。3.3 磷酸。3.4 硫酸。3.5硫酸c（1/2HSO） =2 mol/L：取6mL硫酸（3.4）缓缓注入100mL水中，冷24却摇匀3.6乙醇-水混合液：取90mL无水乙醇和10mL水混合摇匀。3.7磷酸二氢钠缓冲溶液(0.02mol/L, pH=2.2):称取3.12g磷酸二氢钠，加水溶 解并稀释至1000mL，用磷酸调pH值至2.2。3.8 甲醇,色谱纯。3.9苯甲酸，纯度M99.5%。3.10苯甲酸标准储备液Q
3、 (苯甲酸)=1.0g/L:精密称取苯甲酸O.IOOOg于 100mL 容量瓶中，用乙醇 -水混合液( 3.6)溶解并稀释至刻度， 即得浓度为 1.0mg/mL的苯甲酸标准储备溶液。该储备液应在0C 4C冰箱冷藏保存。3.11 系列浓度苯甲酸标准溶液：分别精密量取一定体积的苯甲酸标准储备溶液(3.10)于 10mL 量瓶中，以乙醇-水混合液(3.6)稀释并定容至刻度，得系列浓 度为 0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.20mg/ mL、0.30g/mL、0.40mg/mL、0.50mg/mL 的标准溶液。4仪器和设备4.1 液相色谱仪：具紫外检测器。4.2 气相色谱-质谱仪。4.3分析
4、天平：感量为0.0001go4.4分析天平：感量为0.01g。4.5 涡旋振荡器。4.6 恒温水浴锅。4.7 超声波清洗仪4.8离心机：转速不小于5000r/min。4.9 酸度计。4.10 容量瓶：10mL、50 mL、100mL4.11具塞刻度离心试管：10mLo4.12注射式样品过滤器（有机溶媒型，0.45|am）o5 测定步骤5.1 样品处理称取0.5g1.0g （精确至0.01g）样品于50mL容量瓶中，加入1mL硫酸c（1/2H2SO4） =2 mol/L（3.5）, 30mL乙醇-水混合液（3.6）,涡旋振荡使试样与提 取溶剂充分混匀，置于50C水浴中加热5min,超声提取20m
5、in。冷却至室温后， 用乙醇-水混合液稀释至刻度，在冰浴中放置1h，取出至室温后转移至10mL刻度 离心管中，以5000r/min离心5min。上清液经0.45口m滤膜过滤，滤液作为试样溶 液备用。若样品中苯甲酸的质量浓度超过了线性范围的上限，需对待测液进行适当稀释 5.2色谱条件1. 色谱柱:C18柱（250mm X4.6mm, 5 口 m，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂）；2. 流动相：甲醇-磷酸二氢钠缓冲液（0.02mol/L，磷酸调pH为2.2） （3.7）,梯度洗脱参考条件见下表：时间（mi n）甲醇（）磷酸二氢钠缓冲溶液（）05050105050119010409010415050
6、505050注：梯度洗脱条件，操作者可根据实际样品的不同选择最佳条件，使苯甲酸与化妆品中其他 组分峰获得完全分离。3. 流速：1.0mL/min ；4. 检测波长：230nm ；5. 柱温:35 C ；6. 进样量：10口。5.3 测定按“5.2”项下色谱条件，取系列浓度的标准溶液（3.11）分别进样，进行液相色 谱分析，以系列标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，建立标 准曲线，得到回归方程。取“5.1”项下样品待测溶液进样10口，根据测定成分的峰面 积，代入回归方程计算苯甲酸的浓度。按“6”项下计算公式计算样品中苯甲酸及其钠 盐（以苯甲酸计）的含量。苯甲酸标准溶液高效液相色谱
7、图参见附录 A 的图 A.1。5.4 确证必要时，采用气相色谱-质谱确证阳性结果，以检查化妆品中是否有其它物质干 扰苯甲酸的测定。如果检出的色谱峰的保留时间与标准物质的保留时间一致，并且 在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，且所选择的离子的相对丰度 比与标准物质的相对丰度比一致，则可判断样品中存在苯甲酸或苯甲酸钠。 气相色谱-质谱参考条件1. 色谱柱：HP-FFAP石英毛细管色谱柱（30mx0.25mmx0.25um,硝基对苯二酸改性的聚乙二醇）或相当者；2. 柱温程序：初始温度150C，以10C/min的速率升温至180C，保持3min后，再以20C/min的速率升温至230C，
8、保持5min ；3. 进样口温度：230C；4. 接口温度：240 C；5. 载气：氦气1.0 mL/min；6. 电离方式：EI ；7. 电离能量：70ev ；8. 监测方式：全扫描；9. 监视离子范围（m/z）:20 - 130 ；10. 进样方式：分流进样，分流比：40:111. 进样量：1.0Lo苯甲酸的全扫描图参见附录C的图C.1，-苯甲酸的质谱图参见附录C的图C.2o6计算式中： |苯甲酸及其钠盐（以苯甲酸计）含量样品中苯甲酸及其钠盐（以苯甲酸计）的质量分数，%；工从标准曲线中得出的测试溶液中苯甲酸浓度，mg/mL；V 样品定容体积， mL；m样品取样量，go7 回收率当样品添加标
9、准溶液浓度在0.05% - 0.5%范围内，测定结果的平均回收率在92.5%104.9%。8 允许差在重复条件下获得的同一样品溶液两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的 10%。气相色谱法1范围本方法规定了用气相色谱法测定化妆品中防腐剂苯甲酸（CAS : 65-85-0）及其 钠盐的含量。本方法适用于膏霜、乳、液、粉类化妆品中苯甲酸及其钠盐含量的测定。暂无实验数据表明本方法适用于蜡质类化妆品中苯甲酸及其钠盐（以苯甲酸计） 含量的测定。2方法提要试样经酸化后，用乙醚低温超声提取，提取溶液除去乙醚，残渣用无水乙醇溶 解定容，离心，取上清液经滤膜过滤，采用气相色谱仪分离，氢火焰离子化检测器
10、检测，根据保留时间定性，峰面积定量，以标准曲线法计算含量。本方法的检出限 为0.0025|jg,定量下限为0.0083|jg。若取1.0g样品，本方法对苯甲酸的检出浓度 为 0.0025%，最低定量浓度为 0.0083%。3 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯。水为超纯水。3.1 无水乙醇。3.2 乙醚。3.3 盐酸。3.4 盐酸-水混合液：取 50mL 盐酸（3.3）和 50mL 水混合摇匀。3.5苯甲酸，纯度M99.5%。3.6苯甲酸标准储备液口（苯甲酸）=1.0g/L:精密称取苯甲酸标准品O.IOOOg 于100mL的容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，即得浓度为1.0mg/m
11、L的苯 甲酸标准储备溶液。该储备液应在0C4C冰箱冷藏保存。3.7 系列浓度苯甲酸标准溶液：分别精密量取一定体积的苯甲酸标准储备溶液（3.6 于10mL量瓶中，以无水乙醇（3.1）稀释并定容至刻度，得系列浓度为0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.20mg/ mL、0.30g/mL、0.40mg/mL、0.50mg/mL 的标 准溶液。4仪器和设备4.1气相色谱仪:具氢火焰离子化检测器（FID）。4.2分析天平：感量为0.0001g。4.3分析天平：感量为0-01g o4.4 涡旋振荡器。4.5超声波清洗仪。4.6恒温水浴锅。4.7离心机：转速不小于5000r/min。4.8 容量瓶：5
12、mL、100mLo4.9具塞试管：50mLo4.10具塞刻度离心试管：10mLo4.11 蒸发皿：50 mLo4.12注射式样品过滤器（有机溶媒型，0.45|am）。5 测定步骤5.1 样品处理液体类化妆品：称取0.5g1.0g （精确至0.01g）试样于50mL具塞试管中, 加 0.5mL 盐酸-水混合液（3.4）和 20.0mL 乙醚（3.2），盖上塞子，称重，涡旋振摇 使试样与提取溶剂充分混匀，冰浴超声提取20min,用乙醚（3.2）补足重量，混匀 后静置至溶液分层，准确移取上清液10.0mL于50mL蒸发皿中，40C水浴蒸至近 干，残渣用无水乙醇（3.1）转移至 5mL 容量瓶定容，混
13、匀，再转移至 10mL 刻度 离心管中，以5000r/min离心5min, 上清液经0.45口m滤膜过滤，滤液作为试样溶 液备用。膏霜、乳、粉类化妆品：称取0.5g1.0g （精确至O.OIg）试样于50mL具塞 试管中，口 1ml纯水振摇后加入0.5mL盐酸-水混合液（3.4）及20.0mL乙醚（3.2）, 盖上塞子，称重，涡旋振摇使试样与提取溶剂充分混匀，冰浴超声提取20min,用 乙醚（3.2）补足重量，混匀后静置至溶液分层，准确移取上清液 10.0mL 于 50mL 蒸发皿中，40C水浴蒸至近干，残渣用无水乙醇转（3.1）移至5mL容量瓶定容， 混匀，再转移至10mL刻度离心管中，以5
14、000r/min离心5min, 上清液经0.45m 滤膜过滤，滤液作为试样溶液备用。若样品中苯甲酸的质量浓度超过了线性范围的上限，需对待测液进行适当稀释。 5.2 色谱条件1. 色谱柱：HP-FFAP石英毛细管色谱柱（30mx0.25mmx0.25um,硝基对苯二酸改性的聚乙二醇），或相当者；2. 柱温程序：初始温度150C，以10C/min的速率升温至180C，保持3min后，再以20C/min的速率升温至230C，保持5min ；3. 进样口温度：240C ；4. 检测器温度：250C ；5. 载气：N2，流速：1.0mL/min；6. 氢气流量：40 mL/min；7. 空气流量：400
15、 mL/min；8. 尾吹气氮气流量：30 mL/min；9. 进样方式：分流进样，分流比：40:1；10. 进样量：1|jL。注：载气、空气、氢气流速随仪器而异，操作者可根据仪器及色谱柱等差异，通 过试验选择最佳操作条件，使苯甲酸与化妆品中其他组分峰获得完全分离。5.3 测定按“5.2”项下的色谱条件，取系列浓度的标准溶液（3.7）分别进样，进行气相色 谱分析，以系列标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，建立标 准曲线，得到回归方程。取51”项下样品待测溶液进样1从，根据测定成分的峰面 积，代入回归方程计算苯甲酸的浓度。按“6”项下计算公式计算样品中苯甲酸及其钠 盐（以苯甲酸计）的含量。必要时用第一法佐证。苯甲酸标准溶液气相色谱图参见附录B的图B.1。6计算因式中：|苯甲酸及其钠盐（以苯甲酸计）样品中苯甲酸及其钠盐（以苯甲酸 计）的质量分数，%；乂 从标准曲线中得出的测试溶液中苯甲酸浓度，mg/mL；样品中加入提取溶剂体积， mL
