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1、细菌形态理化鉴定1形态学特性22生理生化特性实验21、尿素酶（Urease）实验22、氧化酶（Oxidase）实验33、过氧化氢酶的测定34、甲基红（Methyl Red）实验45、V-P实验46、含碳/氮化合物的运用47、葡萄糖的氧化发酵实验（O-F实验）58、糖或醇类发酵实验69、硝酸盐（Nitrate）还原实验710、靛基质（Imdole）实验（吲哚实验）711、三糖铁（TSI）琼脂实验812、氨基酸脱羧酶的测定813、硫化氢（H2S）实验814、柠檬酸盐或丙酸盐的运用915、运用丙二酸盐实验916、葡萄糖酸盐的氧化918、-半乳糖苷酶（ONPG）的测定1019、耐盐性实验1020、卵磷
2、脂酶的测定1021、石蕊牛奶的反映1122、酪素水解实验（酪蛋白水解）1123、酪氨酸水解1224、苯丙氨酸脱氨实验1225、产糊精结晶实验1226、从甘油产生二羟基丙酮1227、厌氧硝酸盐产气1228、马尿酸盐水解实验1329、对叠氮化钠的抗性1330、氰化钾实验1331、对溶菌酶抗性的测定1332、在pH5.7营养肉汤上的生长1333、需氧性试样1434、明胶（Gelatin）液化实验1435、淀粉水解实验1436、生长温度的测定1537、形成芽孢的培养基1538、O/129的敏感性实验151形态学特性1.1菌落形态培养到24h后观测平板上单菌落形状、大小、颜色与突起特性。1.2细胞形态光
3、学显微镜观测菌体的形态、大小、运动性等。1.3革兰氏染色取无油迹的干净载玻片，滴上一滴无菌蒸馏水，用接种环挑取少量菌苔，于水滴边沿轻轻涂几下。自然风干，在火焰上通过几次，固定涂片。滴加结晶紫液，染1min，用水冲净结晶紫液。滴加碘液冲净残水，并覆盖约lmin。用水冲去碘液，将片上的水甩干。滴加95%乙醇液脱色约20-30s，并立即用水冲净乙醇。用番红液染l-2min。用水洗净番红，风干，用显微镜油镜观测涂片。1.4芽孢染色取培养24h左右的菌体涂片、干燥、固定。滴加3-5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿使沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少量染液。加
4、热时间从冒蒸汽时开始计时约4-5min。倾去染液，待载玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。用蕃红水溶液复染lmin，水洗。待干燥后，置油镜观测，芽孢呈绿色，菌体呈红色。1.5荚膜染色按常规取菌涂片，空气中自然干燥。用1%的结晶紫水溶液染色2min。以20%的硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干残液。干后用油镜观测。菌体染成深紫色，菌体周边的荚膜呈淡紫色。2生理生化特性实验1、尿素酶（Urease）实验有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，由于不管底物尿素与否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。实验措施：挑取1824h待试菌培
5、养物大量接种于液体培养基管中，摇均，于361培养10，60和120min，分别观测成果。或涂布并穿刺接种于琼脂斜面，不要达到底部，留底部作变色对照。培养2，4和24h分别观测成果，如阴性应继续培养至4天，作最后鉴定，变为粉红色为阳性。培养基配制措施：蛋白胨：1 g ；NaCl：5 g ；KH2PO4 ：2 g ；葡萄糖 1 g ；琼脂：15 g；酚红：0.012g；蒸馏水 1000 ml。除酚红外，溶解上述成分，并调节PH为6.86.9，然后加入酚红批示剂，使培养基呈橙黄色，分装，115灭菌20min。待培养基冷至50左右，加入预先过滤除菌的20%尿素水溶液，使其终浓度为2%。实验措施： 挑取
6、1824h待试菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面，不要达到底部，培养14d观测成果，如为阴性应继续培养一下，作最后鉴定，变为粉红色为阳性。2、氧化酶（Oxidase）实验氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反映。实验措施：在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂12滴，阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色深紫色，Ewing氏改善试剂呈蓝色。阴性者无颜色变化。应在数分钟内鉴定实验成果。注意事项：（1） 盐酸二甲基对苯撑二胺溶液容易氧化，溶液应装在棕色瓶中，并在冰箱内保存，如溶液变为红褐色，即不适宜使用。
7、（2） 铁、镍铬丝等金属可催化二甲基对苯撑二胺呈红色反映，若用它来挑取菌苔，会浮现假阳性，故必须用白金丝或玻璃棒（或牙签）来挑取菌苔。（3） 在滤纸上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸为宜，如滤纸过湿，会防碍空气与菌苔接触，从而延长了反映时间，导致假阴性。3、过氧化氢酶的测定过氧化氢酶又称接触酶，能催化过氧化氢分解水和氧。1 试剂：310过氧化氢（H2O2）2 菌种培养：将测试菌种接种于合适的培养基斜面上，适温培养1824h。3 实验措施：取一干净的载波片，在上面滴1滴310的H2O2，挑取1环培养1824h的菌苔，在H2O2溶液中涂抹，若有气泡（氧气）浮现，则为过氧化氢酶阳性，无气泡者为阴性。也可将过
8、氧化氢溶液直接加入斜面上，观测气泡的产生。4 注意事项：过氧化氢酶是1种以正铁血红素作为辅基的酶，因此测试菌所生长的培养基不可具有血红素或红血球。4、甲基红（Methyl Red）实验 肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5如下，使甲基红批示剂变红。挑取新的待试纯培养物少量，接种于通用培养基，培养于361C或30C（以30C较好）35天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红批示剂12滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴
9、性、即可鉴定成果。甲基红为酸性批示剂，pH范畴为4.46.0，其pK值为5.0。故在pH5.0如下，随酸度而增强红色，在pH5.0以上，则随碱度而增强黄色，在pH5.0或上下接近时，也许变色不够明显，此时应延长培养时间，反复实验。5、V-P实验某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP（+）反映。通用培养基配制措施：蛋白胨5g；葡萄糖5g；NaCl /(K2PO4-一般仅用于肠杆菌各菌属鉴定):5g；蒸馏水：1000mL；PH:7.07.2，分装试管，毎管装约45
10、cm，115灭菌20min。试剂：40% NaOH(或KOH)，6% a-萘酚。实验措施：将实验菌接种于上述培养基，于361C培养4天培养48-96小时，培养液2ml先加入1ml a-萘酚（2-na-phthol）纯酒精溶液，再加40%氢氧化钾水溶液0.4ml，摇动25min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色浮现，静置于室温或361C恒温箱，如2h内仍不显现红色、可鉴定为阴性.本实验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其他细菌时，通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生，故应省去或以氯化钠替代。6、含碳/氮化合物的运用细菌能否运用某些含碳化合物作为唯一碳源，反映该菌与否产生
11、代谢这种化合物的有关酶系，因而作为鉴定根据。测定的基本培养基配方诸多，因种而异。现简介1种合成的基本培养基，有些细菌还可合适补加多种维生素。培养基可制成液体，分装试管，也可制成固体平板。可用于测定的底物种类诸多，有单糖、双糖、糖醇、脂肪酸、羟基酸及其她有机酸、醇、多种氨基酸类胺类以及碳氢化合物等。糖的含量一般为1，醇类酚类等的含量一般为0.10.2，氨基酸的含量一般为0.5。因碳氢化合物不溶于水，可在液体培养基中振荡培养，或加入到45的固体培养基中，振荡后立即倒成平板。有些底物不适宜用高压灭菌，可用过滤法灭菌后加入已灭菌的基本培养基中，某些醇类和酚类不必灭菌。接种和观测成果：菌种最佳做成悬液，
12、避免带入少量碳源干扰实验成果。平板培养用接种环点种，液体培养则用直针接种。每一测定菌必须接种未加碳水化合物的空白基本培养基作对照。适温培养2、5、7天后观测，凡测定菌在有碳水化合物的培养基中生长状况，明显超过空白培养基的生长量为阳性，否则为阴性。假若两种培养基上生长状况差别不明显，开在同一培养基上持续移种3次，如差别仍不明显则以阴性论。(葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、木糖、甘露醇、纤维二糖、乳糖、麦芽糖、纤维素粉、甘油、甘露糖。)（1）菌株对碳源的运用Mandel盐营养液54：NaNO32.0g/L，K2HPO4 1.5g/L,CaCl2 1.5g/L,MgSO4 0.3g/L,FeSO47H2O
13、 5.0mg/L,MnSO4H2O 1.6mg/L,ZnSO4H2O 1.4mg/L,CoCl2 0.5mg/L.Mandel盐营养液+2%琼脂+2%碳源。碳源分别为：葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、蛋白胨水培养基1000mL糖发酵培养基：1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1-2mL，另配20%糖溶液10mL调节pH7.6，115灭菌30min，备用。木糖、甘露醇、纤维二糖、乳糖、麦芽糖、纤维素粉、甘油、甘露糖。每支试管内装10mL培养基，制成斜面培养基,无菌下接种，每种碳源接种二管，一支不接种做对照，31培养。持续3代移种，生长者为阳性。（2）菌株对氮源的运用无氮的Mandel盐营养液+2%琼脂上铺无菌滤纸
14、+1%不同的氮源。氮源分别为：NH4+、NO3-、蛋白胨、酵母膏、尿素，每种氮源制三个斜面，其中一种做对照，无菌条件下接种，31培养4d，观测成果。7、葡萄糖的氧化发酵实验（O-F实验）在细菌鉴定中，糖类发酵产酸是1项重要根据。细菌对糖类的运用有2种类型：1种是从糖类发酵产酸，不需要以分子氧作为最后受氢体，称发酵型产酸；另一种则以分子氧作为最后受氢体，称氧化型产酸。前者涉及的菌种类型为多数。氧化型产酸量较少，所产生的酸常常被培养基中的蛋白胨分解时所产生的胺所中和，而不体现产酸。为此，Hugh和Leifson提出一种具有低有机氮的培养基，用以鉴定细菌从糖类产酸是属氧化型产酸或发酵型产酸。这一实验
15、广泛用于细菌鉴定。一般用葡萄糖作为糖类代表。也可运用这一基本培养基来测定细菌从其她糖类或醇类产酸的能力。（1）接种 ：以1824h的幼龄菌种，穿刺接种在上述培养基中，每株菌接4管，其中2管用油封盖（凡士林：液体石蜡1：1混合后灭菌），约加0.51厘米厚，以隔绝空气为闭管。另2管不封油为开管，同步还要有不接种的闭管作对照。适温培养1、2、4、7天观测成果。（2）成果观测：氧化型产酸仅开管产酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部产碱（12d），后来才稍变酸。发酵型产酸则开管及闭管均产酸，如产气，则在琼脂柱内产气愤泡。8、糖或醇类发酵实验 原理： 不同微生物分解运用糖类的能力有很大差别，或能运用或不能运用，能运用者，或产气或不产气。可用批示剂及发酵管检查。有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号：+）、产气（符号：），培养基由紫（蓝）变黄（批示剂溴甲酚紫或溴百里酚蓝由紫或蓝遇酸变黄的成果），并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类（符号：），培养基仍为紫（蓝）色。培养基配制： 一般细菌常用休和李夫森二氏培养基： 蛋白胨：2g ，K2H
