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1、膜片钳技术的发展与应用崔梦梦（生命科学学院 1241410026）摘要：膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的，该技术的核心是能够记录单一离子通道的电流。膜片钳可以测量到0.06pA的电流，它具有1um的空间分辨率和10us的时间分辨率。作为先进的细胞电生理技术，膜片钳一直被奉为研究离子通道的“金标准”。应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机稍等进行深入的研究。此外，将膜片钳技术与其他一些先进的技术结合，使其在药理学、病理学、神经科学、脑科学、细胞生物学和分子生物学等生物科学方面,，得到了越来越广泛的应用。关键词：膜片钳；离子通道；发展与应用在
2、细胞膜上存在有许多的离子通道，这些离子通道是细胞兴奋性的基础，对细胞内以及细胞之间的信息传递起着非常重要的作用。为探究离子通道的功能和结构，许多电生理技术被发明创造。英国学者Huxley和Katz最早应用电压钳来研究细胞膜上离子通道的电流变化，但由于该技术钳制的细胞膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的离子通道，因而不能测定单一离子通道电流。所以在1976年德国神经生物学家Erwin Neher和Bert Sakmann建立起一种新的技术，即膜片钳技术，并且逐渐取代了电压钳技术。随着膜片钳技术的不断完善，自1981年以来, 该技术已经在不同动物的肝、脾、胃肠、心肌、骨骼肌、神经系统、内分泌等
3、各类细胞上应用并取得了研究成果。膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。一、膜片钳技术的基本原理膜片钳技术是利用玻璃微电极尖端经抛光后贴附于神经元膜上，与玻璃微电极尖端相接的膜仅含13个离子通道，然后通过负压吸引将这片膜与周围的膜实行高阻封接，因此在电极尖端覆盖下的那片膜，在电学上已于膜的其他部分相互分隔。电极尖端下的膜通道开放所产生的电流流进玻璃微电极吸管，通过一极其敏感的膜片钳放大器，就可测量得到单一离子通道电流。电极尖端的直径一般可达0.5um，它与膜的高阻封接可达到10亿欧，因而极大提高了膜片钳技术的可靠性和灵敏度。二、膜片钳技术的改进
4、与新进展（一）穿孔膜片钳技术1988年Horn等对传统全细胞记录进行了改进，建立了穿孔膜片钳技术。即利用某些抗生素具有在生物膜上形成通透性孔道的性质，将这类抗生素充灌在电极液中，在高阻封接形成之后自发形成全细胞记录模式。该技术中，抗生素形成孔道的有效半径为0.40.8 nm，可以选择性地通透Na+ 、K+ 、Li+ 、Cs+ 、Cl- 等一价离子，使细胞内环境相对稳定，电流的衰减现象减弱。并且抗生素对细胞的损伤作用小，高阻封接不易被破坏，记录的持续时间延长。这种技术需要在避光条件下配制含有抗生素的穿孔液，配好后于4避光保存。充灌电极时， 先用不含抗生素的电极液充灌，然后再加入含有抗生素的电极液
5、反向充灌电极。在这个过程中，应快速形成高阻封接，避免抗生素扩散到电极尖端抑制高阻封接的形成。（二）在体膜片钳技术在体全细胞记录膜片钳开始于研究感觉系统对外界刺激的反应特性和机理，因为这在离体标本上几乎是无法实现的。早期研究感觉系统的活体动物实验大多使用细胞外记录方法，这可以研究细胞对自然刺激如光，声音等的反应特性和规律，但不能涉及感觉信息处理的机制。这是因为细胞外单细胞记录只能得到一个细胞的最终输出，即动作电位，而不能获得其突触电位的波形，也忽略了所有的阈下反应。早期膜片钳记录的标本大多为急性分离的细胞，到20世纪80年代末，脑片全细胞膜片钳技术出现，20世纪90年代一些实验室在借鉴脑片膜片钳
6、技术的基础上，尝试在整体动物( 一般是麻醉状态) 上进行膜片钳记录。最早的报道是Pei等在德国马普研究所的工作。他们通过对成年猫视皮层神经元进行全细胞记录，然后观察来自不同方向的光刺激所对应的突触后电流反应，以此探讨视觉信号传递和形成机制， 以及视皮层神经元功能和结构的关系。但可能是由于电极与细胞膜的封接不够好，记录到的细胞静息膜电位绝对值较小，动作电位的幅度也比正常值低很多。随后许多国家都开始了对在体膜片钳技术的研究。目前该技术越来越成熟，记录到的反应也越来越符合实际。（三）全自动膜片钳技术传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞（或一对细胞），对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，它不适在药物开发
7、初期和中期进行大量化合物的筛选，也不适合需要记录大量细胞的基础实验研究，全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题。全自动膜片钳技术是离子通道检测的新技术，它具有直接性、高信息量及高精确性的特点。与传统的膜片钳技术相比，它主要具有以下优点：效率高，是传统膜片钳效率的20300倍；不需要专业电生理人员，简单易用，所有的操作可以在电脑软件控制的界面下完成，无须显微防震系统；大部分仪器的封接质量在1G欧以上；部分仪器同时适用于研究配体门控通道和电压门控通道；主要应用于药物药理和毒理测试；在药物微量加样设计方面表现优秀；仪器主要工作方式为全细胞膜片钳方式。随着基因组测序的完成和蛋白质组学的兴起，
8、离子通道在未来的细胞与药物方面研究将会变得越来越重要。与此同时，作为离子通道研究的最佳伴侣全自动膜片钳技术将会越来越重要，而且其应用领域也将越来越大。三、膜片钳技术的应用（一）在心脏电生理方面的应用人类心脏主要存在Na+通道、K+通道等主要的离子通道。心脏的自发节律性是受心肌细胞的电活动控制的，而心肌电活动的基础便是心肌细胞的各种离子电流的变化。因此膜片钳技术可以用来分析心肌静息电位及其自发去极化的机制，对钠、钾、钙和乙酰胆碱通道的调控机制进行更深入的了解。此外，膜片钳技术也可以用来分析心脏在病理状态下引起通道活性和受体功能改变，从而可以从根本上对各种心脏病进行诊断和治疗。（二）在血管研究中的
9、应用研究发现血管平滑肌细胞的凋亡与K+通道活动增加有关，在动脉粥样硬化发生与发展过程中，电导型钙激活钾通道起着重要的功能作用。某些药物影响动脉粥样硬化血管平滑肌细胞离子通道而发挥作用。膜片钳技术给动脉粥样硬化发病机理研究带来了新的亮点。Wiecha等应用膜片钳技术对冠状As斑块平滑肌细胞与正常冠状动脉平滑肌细胞的特性进行了比较研究。结果表明冠状As斑块平滑肌细胞BKCa比正常冠状动脉平滑肌细胞BKCa有较高的通道活性。这一发现意味着BKCa通道在动脉粥样硬化的发生与发展中起着重要的功能作用。(三)在神经科学中的应用应用膜片钳技术可以研究神经信号的产生和传导。由于中枢神经系统的脆弱性和难以接近性
10、，研究脑的网络特性及其复杂的调控功能是十分困难的。在具有简单网络系统的离体脑片上应用膜片钳技术，为这一方面的深入研究开辟了一个崭新的领域。目前将膜片钳技术应用到神经系统的研究是不少的。但主要侧重于用膜片钳技术观察不同部位细胞形态学和电生理特性的研究；各种化学药物的作用对神经系统影响的研究；适于膜片钳技术研究的细胞的制备及分离方法。（四）在药理学中的应用药物研制的关键在于探测药物作用的靶点。在药物筛选中，将目的药剂以吹打或灌注方式直接施加于培养细胞。借助特定离子通道阻断剂，利用膜片钳方可迅速判明药物作用及作用方式等问题。因此，膜片钳对于药品的研制、生产都有着十分巨大的促进作用。制药企业还可以利用
11、当前新兴药物虚拟筛选技术进行初筛，把初筛结果再结合全自动膜片钳技术进行实验上的验证。虚拟筛选的目的是从数十万到数百万化合物库中筛选出可能的小分子化合物，再进一步进行实验研究。把全自动膜片钳技术结合以离子通道为靶标的高通量虚拟筛选研究技术，无疑将会极大的缩短研究时间和节省大量的研究经费。除此之外，膜片钳技术还可以应用于胃肠道研究、信息传递、中药理论等多个理论中。总之膜片钳技术以其实用、快速、灵敏、准确及重复性好等技术优势已经在大量的研究中得到证实。膜片钳技术为从分子水平了解生物膜离子通道的门控动力学特征及通透性、选择性等膜信息，提供了最直接的手段，使人们对细胞膜通道功能的认识进入了一个崭新的阶段
12、。四、膜片钳技术与其他技术的结合随着科学的发展，越来越多的研究需要多种技术的配合运作。虽然膜片钳技术有很强的记录分析功能，单纯应用仍远不足以研究、解释生命活动的许多现象。因此，出现了与其它技术的结合运用。（一）膜片钳技术与分子生物学技术的结合分子生物学是从分子水平上研究生物的形态结构及其功能的科学，膜片钳技术利用微电极来研究细胞膜上离子通道的通透性和电位的变化，二者之间的结合，可以将神经细胞离子通道的结构特性和物理特性展现出来。同时，可在同一细胞中分离提取特异性表达的mRNA。用膜片钳进行全细胞记录的同时，收集细胞胞浆，然后将mRNA反转录成cDNA，并进行PCR扩增，将PCR产物通过凝胶电泳
13、和DNA序列进行分析。再用特异性引物来区别离子通道亚单位，揭示神经细胞结构和功能的关系，从基因水平研究神经传导通路，提高对神经系统本质的认识。（二）膜片钳技术与荧光技术的结合一些荧光探针常用于检测细胞内的钙离子浓度，它们能与钙离子结合，产生较强的荧光，通过膜片微电极将其引入细胞，可以利用膜片钳记录细胞内的钙离子浓度，钙离子的释放及内流等情况，研究细胞膜钙离子通道的开放、关闭的动力学特征及生理学效应。（三）膜片钳技术与碳纤电极局部电化学微量检测技术的结合如果给碳纤电极一个适当的稳定的电压，使接近或吸附到碳纤电极表面的某些物质发生氧化反应而释放出电子，碳纤电极可俘获这些电子，而电子流过电极产生电流
14、，因此根据所控测部位或培养细胞中某物质氧化时所产生电流的不同，可判别分泌物(被探测物)的种类，并根据电流总量的大小，计算出该物质的分泌量。1992年，Neher实验室首次将膜片钳膜电容检测与碳纤电极联合运用；1994年又将光电联合检测与碳纤电极局部电化学微量检测技术结合，既能研究分泌机制，又能鉴别分泌物质。总之，随着膜片钳技术的进一步完善以及与其他先进技术的结合，使其应用领域越来越广泛，相信随着研究的深入，其在生命科学领域中的应用将会大放异彩。五、对膜片钳技术的展望膜片钳技术自建立以来，不断的发展完善，对生命科学的研究做出了巨大的促进作用。对该技术的应用已经涉及到神经科学、心血管科学、药理学等
15、多个领域。在体膜片钳技术与全自动膜片钳技术的发展使神经科学以及多细胞的研究等领域展开了新的局面。同时随着科学技术的发展与进步，使得膜片钳技术与其他先进的研究技术相结合，从而将膜片钳技术的应用带入到另一个高峰，在生命科学的研究领域中得到更广泛的应用。随着膜片钳技术在生命科学领域的大放异彩，个个研究机构都开始对膜片钳技术进行或多或少的研究，并且将其应用到各个不同的领域，使膜片钳技术得到了更充分的发展与应用。相信在不久的将来，膜片钳技术必将为生命科学的发展做出更重要的贡献。参考文献【1】 曹建斌. 膜片钳技术的发展及其应用. 运城学院学报. 2009年4月,第27卷第2期：5355【2】 曹小于、郑
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