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1、淀粉液化芽孢杆菌抗菌脂肽发酵培养基及发酵条件的 优化方传记，陆兆新，孙力军，别小妹，吕凤霞，黄现青(南京农业大学食品科技学院，南京 210095)摘要：【目的】提高淀粉液化芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)发酵产 脂肽类抗菌物质的产量。【方法】采用Plackett-Burman Design对影响B. amyloliquefaciens ES-2-4产脂肽类抗菌物质产量的13个因子进行筛选，在筛选 结果的基础上，再运用Uniform Design (均匀设计)对关键因子的最佳水平范围 进行研究，通过回归方程求解得到最高产量时各关键因子的最优组合。【结果】 影响抗菌
2、物质产量的关键因子为葡萄糖、L-谷氨酸钠、转速和温度；获得最佳产 量时关键因子的最优组合为：葡萄糖(42 gL-1)、L-谷氨酸钠(14 gL-1)、温 度(27C)、转速(200r/min)，在此条件下，产量从优化前的4.84 gL-1提 高到了 6.76 gLT,增长了 39. 7%。【结论】B. amyloliquefaciens ES-2-4 抗 菌脂肽发酵培养基筛选与优化的过程中，采用Plackett-Burman Design和 Uniform Design相结合的方法，效果显著，经济有效。关键词：淀粉液化芽抱杆菌；抗菌脂肽；发酵；优化；均匀设计Optimization of Fe
3、rmentation Technology for Lipopeptides ProducingBacteri a Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4FANG Chuan-ji, LU Zhao-xin, SUN Li-jun, BIE Xiao-mei, Lu Feng-xia,HUANG Xian-qing(College of Food Science and Technology, Nanjing AgriculturalUniversity, Nanjing 210095)Abstract: 【Objective】 Research technolog
4、y was explored is to increase the yield of lipopeptides produced by bacteri a Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4.【Method】Plackett-Burman Design was used to evaluate the effect of the thirteen factors. In the following phase of the optimization process, Uniform Design was applied to get the optimum co
5、mposition of the crucial factors. 【Result】By statistical analysis, the significant factors affecting the yield of the antimicrobial substance were determined as follows: glucose, L-monosodium glutamate, t empera tu re, rotated speed. And the opti mal composi tion was 42 gL lglucose, 14 gL-l Lmonosod
6、ium glut ama te, 27C and 200 r/min. The produc tion of the anti microbial subs tance increased from 4.84 gLl to 6.76 gL-l, which was 39.7% higher t han that of the cont rol. 【Conclusion】 PlackettBurman design and Uniform Design were simultaneously used in the optimization of the fermentation of lipo
7、peptides producing bacteri a B. amyloliquefaciens ES24, which was proved to be effective and economical.Key words: Bacillus amyloliquefaciens; Lipopeptides; Fermentation; Optimization; Uniform Design0 引言【研究意义】细菌耐药性问题日趋严重，对抗药性革兰氏阳性病原菌具有显 著抗性的脂肽类抗生素1成为人们研究的焦点。芽抱杆菌属（Bacillus）的细菌 能够产生多种抗菌物质，包括脂肽类、肽类、磷脂类
8、、类噬菌体颗粒和细菌素等。 其中脂肽类抗菌物质包括表面活性素（surfcatin）、伊枯草菌素（iturin）和芬 荠素（fengycin）三大类2,具有抗细菌、真菌、病毒和支原体的功能3,在生 物医药方面具有重要的应用价值。此外，抗菌脂肽在石油工业、食品、化妆品和农 业上也有广泛的应用3,4。然而,较高的生产成本和较低的产量限制了抗菌脂肽 的工业化生产,因此寻找能够降低生产成本、提高抗菌脂肽产量的方法是目前迫切 需要解决的问题。【前人研究进展】抗菌脂肽的生物合成受发酵培养基组分和发酵 条件的影响5。许多试验证明碳源、氮源和微量元素在抗菌脂肽生产的过程中起 着关键作用，尤其是微量元素，如Fe2
9、+和Mn2+。最新的研究表明，适量的添加Fe2+和Mn2+能够显著提高抗菌脂肽产量6,7。除此之外，发酵条件如pH、温度、 转速和通气量也能够影响抗菌脂肽的生产5。一般在优化过程中常采用数理统计 的试验方法，R. Sen等5, 8, 9采用响应曲面法(response surfaceMethodology)分别对影响surfactin产量的关键培养基组分、发酵条件以及种龄 和接种量进行了优化研究。Wei等10则通过Taguchi Met hod (Taguchi法)来优 化发酵培养基中微量元素的含量，达到提高产量的目的。【本研究切入点】国内外 对枯草芽抱杆菌(Bac il lus sub ti
10、l is)发酵的优化研究较多，而系统地对淀粉液 化芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)液体深层发酵优化的研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】均匀设计(Uniform Design)具有显著降低试验组数、能够 适合多因素多水平试验设计的优点11，因而可以较好解决上述问题，本研究采用 Uniform Design法对B. amyloliquefaciens液体深层发酵产抗菌脂肽类抗菌物质 (fengycin类)的发酵工艺进行系统研究，通过合理的试验设计来提高抗菌脂肽 产量，减少试验规模，以达到提高产量、降低成本的目标。1 材料与方法1.1 供试菌株及培养基本试验于2006
11、年3月至7月在南京农业大学进行，供试菌株淀粉液化芽抱杆 菌(B. amyloliquefaciens) ES-2-4 (南京农业大学食品科技学院酶工程实验室保 藏)；种子液体培养基：牛肉浸膏5.0 g,蛋白腺10.0 g,酵母膏5.0 g, NaCl 5.0 g,葡萄糖 10.0 g,蒸纟留水 1 000 ml, pH 7.0；基础发酵培养基：葡萄糖20.0 g, L-谷氨酸钠5.0 g, MgS04 0.5 g, KC10.5 g, KH2P04 1 g, FeS04 0.15 mg, MnS04 5.0 mg, CuS04 0.16 mg,蒸纟留水 1 000 ml,pH 7.0。1.2
12、培养方法取斜面置于37C培养箱活化24 h,从新鲜斜面挑取一环接种于种子培养基（250 ml摇瓶，装液量50 ml），摇床（28C, 160 r/min）培养24 h,从种子液 中以一定的接种量接种于发酵培养基（250 ml摇瓶，装液量50 ml），在一定 的条件下（表1、表2）摇床中培养36 h。1.3 脂肽类抗菌物质的提取提取的方法参考文献12并作了一定的修改：将发酵液于10 000Xg冷冻离 心15 min，取1 ml上清液置于2 ml离心管中，真空浓缩干燥（25C），在干燥 样品中加入1 ml 70%甲醇水溶液提取20 min，10 000Xg冷冻离心5 min，离心获 得甲醇提取液，
13、提取液再经0.22 m尼龙树脂过滤，过滤后的滤液即脂肽类抗菌 物质的粗提液，保存在4C冰箱待用。1.4 脂肽类抗菌物质含量的测定定量的方法参考文献13并进行了一定的修改：脂肽类抗菌物质通过HPLC（C18，4.6 mmX250 mmX0.5 口m，AGILENT 1100 series）进行分析检测，流动 相为水和乙腈，梯度洗脱（050 min，H2O 100%0, Acetonitrile 0100%）， 流速为 0.2 ml min-1，紫外检测波长 225 nm （G1314A VWD，JP24020513， AGILENT）。脂肽类抗菌物质纯品可以通过HPLC层析获得。峰面积（x）和抗
14、菌物 质浓度（y）的标准曲线为：y=4E-05x-0.0004 （R2=0.9996）。通过该方程可以计 算出脂肽类抗菌物质的质量浓度（gL-1）。1.5 试验设计1.5.1 影响发酵工艺的关键因子筛选 采用Plackett-Burman Design14分别对影响发酵工艺的13个因子进行筛选，其中X1X8为发酵培养基组分，X9X13为发酵条件。试验设计和数据分析皆采用JMP软件（version 4.0.5, SASInstitute Inc.），每组试验3次重复，结果取平均值。试验设计及结果见表1。1.5.2 发酵工艺的优化设计 采用均匀试验设计表U15 （152X52）对筛 选出的4个关键
15、因子：葡萄糖（x1,15水平）、L-谷氨酸钠（x2,15水平）、温 度（x3, 5水平）、转速（x4, 5水平）进行混合均匀设计。各因子的取值范围分 别为：0Wx1W42 g L1、0Wx2W14 g L1、26CWx3W38C、120 r/minWx4W200 r/min，响应值为脂肽类抗菌物质含量。试验结果为3次重复的平 均值，数据的分析和二次多项式回归方程的建立均采用DPS数据处理系统15。均 匀设计因素水平编码见表2。2 结果与分析2.1 影响抗菌脂肽产量的关键因子通过 JMP 软件（version 4.0.5, SAS Institute Inc.）表1 Plackett-Burman 试验设计表及结果Table 1 Table of Plackett-Burman Design and the results葡萄糖(gL-1)GlucoseX1L-谷氨酸钠(gL-1)L- monosodium glutamateX2MgSO4 KCl(g L- (g LKH2P04 FeSO41) 1)X3 X4(gL- (mgL-1) 1)X5 X6MnSO4(mg L_1)X7CuSO4温度(mgL_(C)pH1)X8Temp.X9接种量转速装液量抗菌脂肽(%)(r/min)(ml)产量（gInoculumR
