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1、一、 整体试验思路：二、 具体实验方法：（一） RNA 提取方法：Unizol 法：1. O.lg样品加lml提取缓冲液（Unizol）,摇晃，放到冰里。2 匀浆：匀浆器用之前要先用 DEPC 水清洗，再用无水乙醇清洗。3. 分别取匀浆液到新管中，盖好，做好标记。12000g 28C离心lOmin。4. 取上清液到另一个离心管中，室温静置 5min。5. 按每ml提取液加入200ul氯仿（三氯甲烷）。剧烈震荡15 秒,室温静置2-5min.6. 12OOOg 28C 离心 15min。7. 取上清，按每ml提取液加入500ul异丙醇，混匀。-20C静置2h。8. 12OOOg 28C 离心 1
2、Omin。9. 去掉上清，加入75%酒精lml （该酒精要用DEPC水稀释），7000g离心7min。10 .去掉上清，干燥。11 .加入20ul或30ul DEPC水溶解。12.取5ul电泳检测，1ul测定浓度及纯度，其余的-80度冰箱保存或直接反转录。 Aidlab RNA 提取试剂盒：（快速、效果好些）1. 匀浆：组织v20mg力口 350ul,组织2030mg力口 600ul裂解液RLTplus,电 动匀浆2040秒。2. 将匀浆后裂解物13000rpm离心3min,将上清液全部加到DNA清除柱上。3. 立刻13000rpm离心60秒，保留过滤液。（确保离心后液体全部滤过去，膜 上没有
3、残留）4. 用移液枪精确估计滤液体积，加入一般体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀， 但不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。5. 立即将混合物（每次小于700ul,多余的可分为两次）加入一个吸附柱RA 中， 13000rpm 离心 30 秒，弃掉废液。6. 加700ul去蛋白液RW1,室温放置1min, 12000rpm离心30秒，弃掉废液。7. 加500ul漂洗液RW, 12000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500ul漂洗液 RW重复一遍。8. 将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2min,尽量除去漂洗液，以 免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。9. 取出吸附柱RA,放入一个RN
4、ase free离心管中，在吸附膜的中间部位加 3050ul RNase free water，室温放置 1min, 12000rpm 离心 1min。10. 若想使 RNA 浓度高，可将第一次的洗脱液加回柱子，重复一遍。（二） 反转录：Takara 公司反转录试剂盒：5xPrimeScript Buffer2ulPrimeScript RT Enzyme Mix10.5ulOligo dT Primer0.5ulRandom 6 mers0.5ulTotal RNA按说明书要求浓度添加RNase Free dH2O加水补齐至总体积为 10ul（注：可成倍扩大体系）反应条件：37C15min8
5、5C5 sec（三） PCRPCR 反应体系：H2O11.6uldNTP mixture3.2ulPCR buffer2ulcDNA1ul正向引物1ul反向引物1ulTaq 酶0.2ul共：20ulPCR反应条件：1.94C4min2.94C30sec3. 52 C45sec（该步退火温度可变）4. 72 Clmin5. Go to 2 cycles 296. 72Cl0min7. 4Cforever（四）实时荧光定量 PCR：Takara 公司 SYBR Premix Ex Taq 试剂盒：内参基因：一般为P-actin。目的基因与内参基因各做3个平行。引物设计要求：PCR扩增产物长度：80
6、150bp最为合适（可延长至300bp） 引物长度： l725 mersGC 含量： 4060% （ 4555%最佳）Tm 值：正反向引物 Tm 值不能相差太大OLIGO： 6368CPrimer 3： 6065C引物序列：A、G、C、T整体分布尽量均匀。不要有部分的GC rich或AT rich（特别是3端）。尽量避开T/C或A/G的连续结构。3末端序列：避免GC rich或AT rich。3端碱基最好为G或C。尽量避免3末 端碱基为 T 。互补序列：避开引物内部或两条引物之间有3个碱基以上的互补序列。两条引物间的3末端避开有2个以上的互补序列。反应体系：SYBR Premix Ex Taq
7、 (2x)10ulPCR 正向引物(10uM)0.4ulPCR 反向引物(10uM)0.4ulcDNA 模板2uldH2O7.2ul共 20ul程序：30s1.95C2. 94C15s3. 58 C20s4. 72C20s+ Plate read5. Go to 2 ， 39 more times6. Melt curve 60.0 to95.0C , increment 0.5C for 0.05s+ plate read7. End（五）基因全长的扩增：引物设计要求：1. 引物长度 2328nt2. GC 含量： 5070%3. Tm 值=65C,最好是70C4. 3端不要跟试剂盒中的 U
8、PM 引物互补5. 与目的基因互补配对Race cDNA 的反转录：采用 Clontech 的 SMARTer RACE cDNAAmplification Kit 试剂盒 （Takara 公司就可以买到） 所有都在冰上加样，加完震荡混匀，再用 mini-Spin 收集，最后加酶。1.3 -race及5 -race均做以下mix,每10ul cDNA合成反应加：5xFirst-Strand Buffer2ulDTT (20mM)1uldNTP Mix (10mM)1ulTotal4ul2.5-RACE3-RACERNA 12.75ul (10ng1ug)RNA 13.75ul5-CDS Pri
9、mer A 1ul3-CDS Primer A1ulSterile H2O补齐Sterile H2O补齐Total3.75ulTotal4.75ul3. 混好,收集, 72C3min,42C2min。4. 冷却后14000g离心10s,收集到底部。5. 5 -RACE 力口 1ul SMARTer IIA oligo 每个反应。6. 以上4.75ul 3及5-RACE cDNA加以下试剂：第一步混好的 Buffer mix 4ulRNase Inhibitor (40U/ul) 0.25ulSMARTScribe Reverse Transcriptase (100U)1ul共：10ul。7
10、轻轻地用移液枪混匀，收集到管底。8. 42 C90min,70 C10min。9 用 Tricine-EDTA Buffer 稀释：总 RNA =200ng，加 100ul10. cDNA在-20C 可保存3个月。RACE PCR反应体系：(采用Takara公司的Ex HotStar酶)ddH2O15.37ul10xEx HotStar Buffer2.5ul10xUPM2.5uldNTP (2.5mM)2ulcDNA2ul引物 （10uM）0.5ulEx HotStar Taq 酶0.13ul共： 25ulRACE PCR 反应程序：1. 如果引物Tm值70C，最好用下面的Touch down程序（特异性高）Touch down 程序：5 cycles：94C30sec72C3min5 cycles：94C30sec70C30sec72C3min25 cycles：94C30sec68C30sec72C3min2.如果引物Tm值较低，在6070C之间，也可以用下面这个程序:20 cycles 或 25 cycles：94 C30sec68 C30sec72 C3min
