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1、FLAG标签(DYKDDDDK)融合蛋白纯化试剂盒Cat# : KAP0064(本品仅用于科学研究，不可用于诊断及治疗)1. 背景信息Flag-Tag( DYKDDDDK)，常用于真核蛋白质重组表达标记。FLAG标签(DYKDDDDK) 融合蛋白纯化试剂盒，主要成分是An ti-Flag亲和纯化凝胶(An ti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel)，由高品质的Flag兔多克隆抗体与Sepharose 4B琼脂糖颗粒共价偶联制成，具有高载量 (至少为1.2mg protein/ml凝胶)，高特异性，性质稳定，可反复使用的特点，可用于Flag 标签融合蛋白的亲和纯化。2. 性
2、能指标应用范围：可用于Met修饰的N端Flag融合蛋白(Met-Flag-Protein ),N端Flag融合蛋 白(Flag-Protein )和C端Flag融合蛋白(Protein-Flag )的亲和纯化。载量：1ml Sepharose 4B琼脂糖颗粒，共价偶联800pg Anti-Flag兔多克隆抗体，可纯化至 少1.2mg Flag融合蛋白。强度： 重力柱纯化，可反复使用5次以上。保存方法：在加入了 50%甘油和0.2%。叠氮钠的PBS保存液后，预装纯化柱可于-20弋可保存 1年。3. 试剂盒组成组分内容物/配方数量保存预装纯化柱：容积12ml1ml共价偶联Anti-Flag兔多克隆
3、 抗体的Sepharose 4B琼脂糖颗粒， 溶于2ml PBS+50%甘油中1份-20C年细胞裂解液：25ml/瓶50 mM Tris HCI, pH 7.4, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, and 1% Triton X-100 （说明见 5.3）2瓶室温一年3 x Flag peptide 洗脱液:1mg/份3xFlag peptide干粉，使用刖溶于10 ml IxPBS，工作浓度为100p g/ml1份4C年酸性洗脱液：25ml/瓶0.15M Argi nin e-HC l 缓冲液，pH3.01瓶4C年中和液：25ml/瓶1M Tris HCl 缓冲液，pH8.01
4、瓶4C年1OxPBS（清洗液/储存液）：25ml/瓶1.5M PBS buffer , pH7.5 , with 2%。Azide （使用时须用双蒸水稀 释10倍）2瓶4C年酸性预洗液：25ml/瓶0.15M PBS buffer, pH5.01瓶4C年4. 使用方法4.1细胞裂解液制备4.1.1 悬浮细胞和半贴壁细胞从细胞培养瓶上吹下来后放入离心管中， lOOOrpm离心5分钟。贴壁细胞用细胞刮子轻轻从瓶壁上刮下来，放入离 心管中1000rpm离心 5分钟。4.1.2预冷的PBS工作液重悬细胞，1000rpm离心 3min，弃上清。重复一次。4.1.3 根据细胞的量加入相应体积的细胞裂解液，
5、 反复吹打后冰上放置 10-20min，让细胞充分裂解。4.1.4 用超声破碎仪将细胞裂解液超声，直至细胞裂解液透明，不再粘稠。冰上 放置30min之后，12000rpm , 4C离心10min。取上清，冷冻保存。4.2装柱及孵育4.2.1 10ml （10倍柱体积）PBS清洗Anti-Flag亲和纯化柱。4.2.2加入含有目标蛋白的真核细胞裂解液，室温孵育或者4C孵育过夜。4.2.3 根据蛋白质性质选择洗脱方法，具体可参见第5部分问题和建议5.1。4.3 3xFlag peptide洗脱液竞争洗脱4.3.1用1xPBS酉己制3xFlag peptide洗脱液，终浓度为100pg/ml。4.3
6、.2加入10ml 3xFlag peptide洗脱液（10倍柱体积）进行洗脱，每次收集 1ml。4.3.3 用紫外检测仪测定收集液, 合并收集液。4.3.4 SDS-PAGE鉴定蛋白质纯度及浓度，并按照需求处理和保存蛋白质。4.4酸性洗脱液酸性洗脱4.4.1 5ml PBS （ 5倍柱体积）洗柱三次。4.4.2预冷的5ml pH 5.0酸性预洗液（5倍柱体积）洗涤纯化柱，除去非特异性 结合蛋白。4.4.3预冷的10ml pH 3.0的酸性洗脱液（10倍柱体积）进行洗脱，每次收集 1ml,收集管中预先放入中和液50川。注意：酸性环境放置太久会缩短亲和 纯化柱的使用寿命，应尽量缩短亲和纯化柱与酸性
7、洗脱液的接触时间。4.4.4 用紫外检测仪测定收集峰, 合并收集峰。4.4.5 SDS-PAGE鉴定蛋白质纯度及浓度，并按照需求处理和保存蛋白质。4.5纯化柱的清洗与再生（洗脱后须立即进行纯化柱的清洗与再生）4.5.1 10倍柱体积PBS清洗纯化柱。4.5.2酸性洗脱液（pH3.0 ）洗涤纯化柱，每次三倍柱体积。4.5.3中和液（pH8.0 ）洗涤柱子三次，每次三倍柱体积。4.5.4检测流穿液pH，如为中性，则进行下一步；如仍为酸性，则重复4.5.2和 4.5.3。4.5.5用1xPBS （含50%甘油，0.2%。叠氮钠）清洗，再加入适量该保存溶液至 填料中，保存在20C。4.6保存纯化产物加
8、入50%甘油保存在-80度，用于后续功能性实验。5. 问题与建议5.1 如何选择竞争性洗脱和酸性洗脱？3xFlag peptide洗脱液与蛋白质上的Flag标签竞争亲和纯化柱上的抗体，使蛋白质 与抗体的结合被取代而脱离纯化柱，从而被洗脱下来。这种洗脱的特点有：5.1.1 洗脱条件温和，一般不会造成蛋白质变性；有利于亲和纯化柱的保存和反复 使用。5.1.2 由于亲和吸附达到平衡比较慢，所以往往需要较常的时间和较大的洗脱体积。5.1.3 特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。 基本上不会有anti-Flag的抗体被洗脱下来。酸性洗脱是通过改变环境pH，破坏抗原抗体的结合
9、从而使蛋白质脱离纯化柱被洗脱下 来，这种洗脱方式的特点有：5.1.4 成本低廉。5.1.5 纯化速度较快。5.1.6酸性pH会造成部分蛋白质变性，引起目的蛋白质沉淀，降解或失活。5.1.7有时会有少部分Anti-Flag抗体被洗脱，造成非特异性信号。5.1.8 反复使用酸性洗脱，会造成抗体脱落，也会破坏纯化柱的理化性质，减少纯 化柱的反复使用次数。5.1.9有文献显示，与传统的Glycine-HCI洗脱液相比，本试剂盒提供的pH3.0 的Argi nin e-HC l做为洗脱液，可以减少蛋白质变性，延长抗体亲和纯化柱的 使用寿命。客户可以根据实际情况自行选用配制。5.2 常见的蛋白质的后续处理
10、方法有哪些？5.2.1 透析与超滤透析法是利用半膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤法是利用高压力或离 心，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜而蛋白留在超滤管内。两者都可 以达到换液的目的。使用时需注意选择正确分子量的透析袋和超滤管。5.2.2 过滤除菌可采用微孔滤膜滤器操作，让蛋白质溶液通过0.22um滤膜，即可达到除菌 的目的。5.2.3 蛋白质定量鉴定浓度。5.2.4 SDS-PAGE 鉴定纯度。5.3 如何选择细胞/组织裂解液？本试剂盒提供的细胞裂解液成分如下：Nacl150mMTris-HCL(PH8.0)50 mMTRITONX-1001%EDTA1mM使用前可加入1%PMSF和0.
11、5%原钒酸钠，或其他蛋白酶抑制剂，避免蛋白质降 解。客户可根据目的蛋白的性质和后继用途，自行配制细胞裂解液及选择是否加入蛋白酶抑制剂。6. 使用中的常见问题问题可能原因推荐解决方案柱子反压过高填料被堵塞清洗树脂。裂解液中含有微小的固体颗粒，反复离心取上清，避免堵塞纯化柱；建议上样前 最好用0.22pm或0.45pm滤膜过滤，或离心去除。样品太黏稠样品中含高浓度的核酸，延长破碎时间直至粘度降低，或添加DNasel （终浓度 为 5pg/ml），Mg2 + （终浓度 1mM），冰上孵育 10-15min缓冲液太黏稠有机试剂或蛋白稳定试剂（如甘油等）可能会引起反压增高，降低操作流速。洗脱组分中无目的
12、蛋 白Flag标签蛋白变性了 过度的裂解使目的蛋白变性使用温和的裂解条件，实验条件以经验为准。Flag多肽失效更换Flag多肽融合蛋白改变了 Flag的构 象，影响了目的蛋白的结合如果载体中Flag有很高的亲和力有可能是改变融合蛋白的构象从而降低了 Flag 标签蛋白的亲和力。力降低结合温度至4弋，充分清洗。目的蛋白没有完全洗脱下来洗脱体积太少增加洗脱液体积，减小洗脱流速。洗脱液中Gly-HC 1的pH发生改变使用新鲜配制的洗脱液洗脱液孵育时间不够增加洗脱液与凝胶的孵育时间电泳检测中发现多条44+带Flag融合蛋白已经发生降解在裂解液中加入蛋白酶抑制剂，如加入1 mM PMSF细胞破碎过度减少细胞破碎时间，超声前加入溶菌酶（菌液体积的0.1倍10mg/m l溶菌酶，25mM Tris-HCl，pH8.0 ），避免发泡导致蛋白酶变性。来源出处：武汉戴安生物技术有限公司
