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1、实验一 培养基母液的配制一、实验目的 培养基配制前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素 铁盐、有机物质、激素分别配制成比培养剂配方需要量大若干倍的母液。当 配制培养基时，只需要按预先计算的量吸取母液即可。通过本次实验，了解 培养基母液的配制及保存的方法。二、实验安排 分组进行，每组完成部分配制工作，共同完成一批母液的配制。三、试剂与器材1、试剂：各种激素，蒸馏水。2、器材：不同感量天平、烧杯(1000, 500, 50ml)、量筒(1000, 100, 50ml)、 容量瓶(1000, 200, 100, 50ml)、细口瓶(1000, 100, 50ml)。四、操作方法1 、大
2、量元素母液的配制表1-1大量兀素母液各/化合物用量化合物名称培养基配方用量(mg/L)扩大10倍称量(g)KNO3190019NH4NO3165016.5MgSO4.7H2O3703.7KH2PO41701.7CaCl2.2H204404.4各成分按照表1-1配方称量，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到1000ml 的容量瓶中,即为10倍的大量元素母液。倒入细口瓶,贴好标签保存于冰箱 中。配制培养基时，每配1L培养基取此液100ml。2、微量元素母液的配制按表1-2配方用感量为0.0001g的分析天平称量。配制培养基时，每配制 1L培养基，取此液1ml。表1-2微量兀素母液各,化合物用量化合物名
3、称培养基配方用量(mg/L)扩大1000倍称量(g)MnSO4.4H2O22.322.3ZnSO4.7H2O8.68.6CuSO4.5H2O0.0250.025H3BO36.26.2Na2MoO4.2H2O0.250.25KI0.830.83CoCl2.6H2O0.0250.0253、铁盐母液的配制铁盐如果用柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。若是硫酸亚铁 和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。配制方法是按照表 1-3 配方称量，然后将FeSO4和Na2EDTA分别用蒸馏水加热搅拌溶解，混合两种 溶液继续煮沸，冷却后定溶至1000m 1。配制培养基时，每配制1L培养基取 此液 1
4、0ml。表 1-3 铁盐母液各化合物用量化合物名称培养基配方用量（mg/L）扩大100倍称量（g）Na2EDTA37.33.73FeSO,27.82.784、有机附加成分母液的配制按表1-4用量称量并分别溶解于蒸馏水中，然后定容至500m 1,贮存在棕色无菌瓶中。配制培养基时，每配制1L培养基取此液5ml。表1-4有机附加成分母液各化合物用量化合物名称培养基配方用量（mg/L）扩大100倍称量（g）硫胺素（VB）0.40.02吡哆醇（vb6）0.50.025烟酸0.50.025甘氨酸20.1肌醇10055、激素的配制按表1-5用量称量，并先用相应的少量有机溶剂进行溶解，在用蒸馏水定 容至50m
5、l。贴好标签，写明配制的激素的浓度，贮存在冰箱中。表1-5激素母液配制用量及相应的有机溶剂激素名称配制用量（mg）有机溶剂2,4-D2595%酒精萘乙酸（NAA）2595%酒精吲哚乙酸（IAA）2595%酒精6-BA251mol HCl 或 1mol NaOH激动素（KT）251mol HCl 或 1mol NaOH赤霉素（GA3）2595%酒精五、关键步骤与注意事项1、Ca2+和SO42-, PO43-一起溶解后会产生沉淀，配制时一定要充分溶解再放 入母液中。2、配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。3、药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。4、药品的称量及定容都要准确。六、思考题1、配制培养基母液
6、时应注意哪些事项？实验二 MS 培养基的制备一、实验目的 通过本次实验操作，学习培养基配制与灭菌的操作方法。二、实验安排分组进行，每组配制500ml培养基。三、试剂与器材1、试剂：各种激素，培养基母液，lmol HC1, lmol NaOH,蒸馏水等。2、器材：高压灭菌锅，量筒，烧杯，烧瓶，移液管，容量瓶，封口膜， pH 值试纸，电炉，粗天平。四、操作方法1、根据所配培养基的要求，按表2-1从各母液中量取出大量元素、微量元素 铁液、有机物、激素母液，置于100 ml烧杯中，备用。表2-1培养基母液用量（ml）r .日1 h- 大量兀素（10 倍）微量兀素 （1000倍）有机附加成分 （200倍
7、）铁盐母液 （100 倍）激素500.52.55临时定2、取500ml大烧杯一只，加入300ml蒸馏水，称取琼脂3.5g加入大烧杯中加热 溶解，并不断搅拌。称取蔗糖15g加入溶解的琼脂中，加热呈透明状即可。3、将取好母液加入到溶解好的琼脂溶液中，不断搅拌使培养基混合均匀。加 蒸馏水至500ml。4、用lmol HCl或1 mol NaO H溶液将pH值调至5.8。5、将配制好的培养基分装于清洗干净、烘干的三角瓶中，培养基高度约lcm 左右。6、用封口膜包扎分装好培养基三角瓶的瓶口，用线绳扎紧。并做好标记。7、高压蒸汽灭菌。培养基内含有丰富的营养物质，有利于细菌和真菌繁殖，所以培养基配 好后要及
8、时灭菌，用高压锅灭菌注意以下几点：检查锅内的水量，一般高度到支持锅座水平即可。盖好锅盖，拧紧螺旋，然后检查排气阀是否通畅。打开放气阀加热，使锅内冒出大量热气，以排尽锅内空气。关闭放气阀， 继续加热。当高压锅内温度达121C，压力0.1Mpa时，保持1520分钟后，切断电源， 使锅内压力自然慢慢下降，也可缓缓打开放气阀放气，使锅内压力接近于0（气 压表指针下降至0）。打开锅盖，取出培养基、灭菌水、培养皿、滤纸等灭菌物品。培养基灭菌 后不宜久放，一般不超过一个月，多数情况灭菌后两周内使用完。五、关键步骤与注意事项(1)锅内冷气必须排尽，否则压力表指针虽然达到一定压力，但由于锅内冷空 气的存在并达不
9、到应有的温度，因而影响灭菌的效果。当达到一定压力后，在保持压力过程中要严格遵守时间，时间过长会使一 些化学物质遭到破环，影响培养基成分，时间过短则达不到灭菌效果。三角瓶中的液体不超过总体积的70%，否则当温度超过100C时，培养基会 喷溢，造成培养瓶壁和封口膜的污染。锅内灭菌物品不能装得太满，上部要保留30%的空间。六、思考题1 、配制培养基前需做好哪些准备工作？2、试述培养基的灭菌全过程(以手提式高压灭菌器为例)。实验三 无菌种子发芽一、实验目的 通过本次实验掌握外植体灭菌及无菌操作技术，为愈伤组织诱导建立无 菌培养物。二、实验安排 分组进行，培养基需提前制备好。三、试剂与器材1、材料：油菜
10、种子2、试剂：各种激素，培养基母液，lmol HC1, lmol NaOH, 0.1%HgCl溶液, 无菌水，蒸馏水等。3、器材：高压灭菌锅，量筒，烧杯，烧瓶，封口膜， pH 值试纸，电炉，超 净工作台，培养皿，镊子，酒精灯。四、操作方法1、培养基制作在1000ml烧杯中加入500ml蒸馏水；取MS培养基母液中大量元素母液100m 1、微量元素母液1ml、铁盐母液10ml、有机附加成分母液5ml；称8g琼脂，溶解，混合；定溶到1000ml，调整pH值至5.8；分装于150ml三角瓶中；高压灭菌消毒。2、种子灭菌用纱布包住若干种子并系住（不能太紧），放在小烧杯中；用70%的酒精浸泡2-3min，
11、倒掉酒精；加0.1% HgCl溶液；摇动 5-10min；倒掉HgCl溶液，用无菌水清洗种子3遍。3、接种接种室喷洒酒精降尘，然后开启超净工作台的风机和紫外等；操作员准备：用肥皂洗手，更换衣帽鞋，用酒精擦拭双手，关掉紫外等；超净工作台灭菌：用酒精擦拭一遍超净工作台的工作面，点燃酒精灯，把 放剪刀镊子的架子、镊子等用具蘸酒精后再酒精灯上灼烧；在超净工作台上对材料进行灭菌（方法如上述）。灭完菌后，从小烧杯中把 种子取出，放于无菌培养皿中，然后解开纱布包；把装有培养基的三角瓶解开，再酒精灯上烧一下瓶口，用镊子把种子夹起 放在培养基中，每个三角瓶放20 粒种子。作完后用具清理归位。4、观察 接种后，观
12、察污染及生长情况，统计发芽率直至长成小植株。种子名称接种日期观察日期接种种子数目污染数目污染率(%)发芽数目发芽率(%)五、思考题1、试述外植体灭菌的全过程。实验四 愈伤组织诱导一、实验目的 许多组织培养实验第一步就是要从外植体诱导愈伤组织，这些外植体可以是无菌发芽种子，或者是通过表面灭菌的根、茎、叶等。诱导的愈伤组织 可以用来进行器官发生、原生质体分离、体细胞胚胎发生、次生代谢物生产、 转基因表达等。二、实验安排 分组提前制备好培养基，接种单独完成。三、试剂与器材1、材料：油菜无菌苗、牡丹、银杏。2、试剂：培养基母液，lmol HC1，lmol NaOH，2,4-D，无菌水，蒸馏水等。3、器
13、材：高压灭菌锅，量筒，烧杯，烧瓶，封口膜， pH 值试纸，电炉，超 净工作台，培养皿，镊子，酒精灯。四、操作方法1、诱导培养基配制油菜： MS+1.0mg/L 2,4-D牡丹1： MS+1.5 mg/L NAA +1.0 mg/L 6-BA牡丹2： MS+0.5 mg/L NAA +1.0 mg/L 6-BA 银杏1： MS+3.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA 银杏 2： MS+4.0 mg/L NAA +0.5 mg/L 6-BA2、实验方法(1) 将叶片切成约0.4cmx0.4cm的小片，将幼茎切成长约0.5cm的切段，分 别接种于愈伤组织诱导培养基。在每个100mL
14、规格的三角瓶中接种3块外植 体，每一材料在各培养基中接种2瓶，重复3次，接种后20d时统计愈伤组 织的诱导情况。(2) 将最佳发育时期的花蕾采后，自来水冲洗Zh，2%次氯酸钠消毒20 min， 无菌水冲洗4-5遍， 70%酒精消毒205，之后用无菌水冲洗4-5遍，用滤纸将 多余水分吸干，在无菌条件下将花药剥离接种。3、培养在光照培养箱中培养，温度23-28C。4、观察接种一周后，观察污染情况；以后每隔一周观察接种材料的生长情况，统 计愈伤组织形成率。名称接种日期观察日期接种材料数污染材料数污染率(%)愈伤组织形成数愈伤组织形成率()愈伤组织生长状况五、思考题1 、试述超净工作台的无菌操作技术2、试述愈伤组织诱导的主要技术。实验五 植物离体快繁一、实验目的 在植物快速繁殖中，经常采用带结间的茎段作为外植体，通过腋芽萌发获得小植株。本试验通过对月季茎段和长寿花的培养，掌握茎段的剪切要求 插放，进一步掌握无菌操作技术。二、实验安排 分组提前制备好培养基，接种单独完成。三、试剂与器材1、材料：月季；豆瓣绿；长寿花；芦荟、2、试剂：6-BA，NAA，培养基
