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1、蛋白相互作用Pull-Down实验实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。是 确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。Pull-Down实验可用来检测已知 的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。用作诱饵的蛋白是重组蛋白，会含有一个用于纯化的亲和标签。这个融合标 签就是用于Pull-Down实验的基础。最常见的标签为谷胱甘肽S-转移酶（GST） 和多组氨酸（6His）。其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和配体（如Ni2+和Co2+）。Phase 1In vitro FYey Pnolein Synlhesis (TNT T7 S
2、ystoniPhase 2Immobilization of Bait (GST-fusion) Protein ontc MagneGiSTT* PartidasEluteprey protein delectedFigure L Drerview of the NIagiieGST Pull-Down System prattKol. F = Prey Protein,. M = MagneGST Particle.实验准备：实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶(镍离子琼脂糖凝胶)、离心机、实验材料：表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液实验试剂：Binding Buffer/Washing Buff
3、er: 4.2mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、 140mM NaCl、10mM KClSDS loading Buffer: 50mM Tris-Cl(pH6.8)、2%SDS、0.1%漠酚蓝、10%甘油、 10mM DTT裂解缓冲液：20mM Tris-Cl(pH8.0)、 200mM NaCl、 1mM EDTA(pH8.0)、 0.5% Nonidet P-40 使用前加入加入蛋白酶抑制剂。(蛋白酶抑制剂：2ug/ul抑肽酶 (aprotinin)、1ug/ul 白胃素(leupeptin)、0.7ug/ml 胃酶抑素(pepstatin)、25ug/ml 苯甲磺酰 氟(PM
4、SF) 实验方法： 方法一：1、预清除细胞裂解液：将细胞裂解液与50ul的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25ug GST在4 C混 合孵育2h。离心机12,000g在4C离心2min。将上清转移至新的离心管中。2、探测细胞裂解液两个含等量预清除细胞裂解液及50ul谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。在 一管中加约10ug的GST蛋白，另一管中加约10ug的GST融合探针蛋白。两个反应中加入的探针和对照蛋白质的量应该是等摩尔的。将离心管在4C 翻转混合孵育2h。最大速度在4C离心样品2min。在新的微量离心管中收集上清。用1ml冰冷的裂解液洗球珠。在离心机上以最大速度离心1ml。弃去上清。 重复洗三
5、次。加入50ul 20mmol/L的还原型谷胱甘肽到球珠中，洗脱GST融合蛋白及任何 与其结合的蛋白质。在离心机上最大速度离心2min。将洗脱蛋白质与等体积的2 XSDS-PAGE上样buffer混合。3、检测相互作用蛋白质将样品煮沸4min，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。方法二：1、5ug目的GST融合探针蛋白和GST蛋白分别和谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠 在4C孵育结合30min。2、结合GST融合探针蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠与100ul细胞裂解液 结合在4C作用4h。3、3000rpm在4C离心 5min，除去上清。4、用洗涤缓冲液重悬谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠，3000rpm在4C离心
6、5min, 除去上清，重复5次。5、取谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠进行SDS-PAGE电泳分析。方法三：实验试剂:PBS( 140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4) Elution Buffer: 50mM Tris-Cl(pH8.0)、10mM 还原型谷胱甘肽 0.154g 溶解到 50ml 50mM Tris-Cl(pH8.0)中配制 Elution Buffer。1、细胞裂解取1ml细菌培养液离心去上清，加200ul细胞裂解液到菌丸，在室温下重 悬并轻柔的混匀。将其在室温下晃动孵育20-30min。2、固定GST融合蛋白到柱子上将谷胱甘肽琼
7、脂糖凝胶颠倒混匀后取20ul到1.5ml离心管中，小心去除上 清，加250ul Binding Buffer或wash Buffer到凝胶中，混匀。重复洗3次以上。平衡好的凝胶用 100ul Binding Buffer 或 wash Buffer 重悬。加 200ul 含 GST 融合蛋白的细菌裂解液，在旋转的台子上室温下孵育30min。小心移去上清，(保存以便分析，)将250ul Binding Buffer或wash Buffer 加到凝胶中，轻柔混匀，在室温下孵育5min。小心移去上清。加入250ulBinding Buffer 或 Washing Buffer 再次清洗，将凝胶用 2
8、0ul Binding Buffer 或 wash Buffer 重悬。3、捕获猎物蛋白将5ul固定GST融合蛋白的凝胶中加入20ul含猎物蛋白的溶液，将155ul Binding Buffer或wash Buffer和20ul 10%BSA加入凝胶中，在室温下旋转孵 育1h。移去上清。将400ul Binding Buffer或wash Buffer加入凝胶中，轻柔混匀，在室温下孵 育5min，移去上清。加400ul Binding Buffer或wash Buffer再次清洗凝胶。 小心移去上清。分析：加20ul SDS-PAGE loading Buffer，在室温下混合5min。取出上
9、清用于 分析。His Pull-Down 方法实验试剂：Binding Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0)、150mM NaCl、20mM 咪唑Elution Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0)、300mM NaCl、500mM 咪唑实验步骤：1、结合蛋白裂解后，经0.45um滤膜过滤，2、与Ni-NTA树脂(1ml蛋白裂解液上清结合5ul树脂)4C混合孵育3h。3、待树脂沉淀后用10倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液洗去杂蛋白。4、用6倍柱体积镍柱洗脱目的蛋白。5、纯化后的蛋白用PBS和超纯水透析，冻干。6、SDS-PAGE电泳分析7、纯化的蛋白与Ni-NTA树
10、脂冰浴作用2h，8、10倍柱体积洗涤缓冲液洗涤，9、然后加入过量100ug/ml蛋白溶液，冰浴作用2h，10、用10倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液清洗，11、加入1倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，12、洗脱蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定。13、阴性对照为结合蛋白溶液加入Ni-NTA树脂中冰浴作用2h。10倍柱体积 的镍柱洗涤缓冲液清洗，加入1倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，注意事项：1、所有过柱的液体都要经过0.45um或0.22um的滤膜。2、平衡柱子：2.1用3-5个柱体积蒸馏水洗柱2.2用3-5个柱体积的binding buffer平衡柱子。3、洗柱：如谷胱甘肽琼脂糖凝胶的柱子失去结合能力，需要洗去柱子上的杂质3.1除去变性物质，用2个柱体积的的6M盐酸胍洗柱子，然后用5个柱体积 的PBS洗柱3.2除去疏水性物质，用3-4个柱体积的70%乙醇或2个柱体积的含1%Triton X-100的PBS洗柱，然后用5个柱体积的PBS洗柱4、柱子的保存用3-5个柱体积的超纯水洗柱后，用3-5个柱体积20%的乙醇洗柱后将柱子 保存于4C冰箱5、Ni离子柱的洗柱程序和柱子的保存同带His标签融合蛋白纯化的步骤。
