《HE染色概念、定义及操作步骤》由会员分享，可在线阅读，更多相关《HE染色概念、定义及操作步骤（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、He染色介绍苏木精一伊红染色法(hematoxylin-eosin staining )，简称HE染色法，石 蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞 质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红染色分类易于被碱性或酸性染料着色的性质称为嗜碱性(basophilia )和嗜酸性(acidophilia ) 。组织内的蛋白质构成蛋白质的氨基酸的种类很多，它们有不同的等电点。在普通染 色法中，染色液的酸碱度为pH6左右，细胞内的酸性物质如细胞核的染色质、腺细胞和 神经细胞内的粗面内质网及透明软骨基质等均被碱性染料染色，这些物质称为嗜碱
2、性。 而细胞质中的其它蛋白质如红细胞中的血红蛋白、嗜酸粒细胞的颗粒及胶原纤维和肌纤 维等被酸性染料染色，这些物质称为嗜酸型。如果改变染色液的酸碱度，pH值升高时，则原来被酸性染料染色的物质可变为嗜碱性；pH值降低时，原来被碱性染料染色的物质 则可变为嗜酸性。所以说染色液的pH值可以影响染色的反应。去氧核糖核酸(DNA)两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸核，很容易与带正电 荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中称蓝色，所以细胞核 被染成蓝色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与 蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔
3、组织、嗜 伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。伊红是细 胞浆的良好染料。由于组织或细胞的不同成分对苏木精的亲和力不同及染色性质不一样。经苏木精染 色后，细胞核及钙盐粘液等呈蓝色，可用盐酸酒精分化和弱碱性溶液显蓝，如处理适宜， 可使细胞核着清楚的深蓝色，胞浆等其它成分脱色。再利用胞浆染料伊红染胞浆，使胞 浆的各种不同成分又呈现出深浅不同的粉红色。故各种组织或细胞成分与病变的一般形 态结构特点均可显示出来。染色结果细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。 细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。 胶
4、原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变。例如，彳艮 多细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现 嗜伊红浓染。胶原纤维在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深。常规HE染色步骤(1)二甲苯(I)5-10 min(2)二甲苯(II)5-10 min1-3 min95%乙醇(I)(4) 95%乙醇(II)(5) 80%乙醇(6) 蒸馏水(7) 苏木精液染色(8 )流水稍洗去苏木精液1%盐酸乙醇(10) 稍水洗(11) 促蓝液返蓝(12) 流水冲洗(13)蒸馏水过洗(14
5、) 0.5%曙红液染色(15) 蒸馏水稍洗(16) 80%乙醇稍洗(17) 95% 乙醇(I)(18) 95% 乙醇(II)(19) 无水乙醇(20) 无水乙醇(21) 二甲苯(I)(22) 二甲苯(II)(23) 二甲苯(III)(24) 中性树胶封固结果：细胞浆红色，细胞核蓝紫色。1-3 min1 min1 min5-15 min1-3 s1-3 s10-30 s10-30 s10-15 min1-2 s1-3 min1-2 s1-2 s3-5min3-5 min5-10 min5-10 min3-5 min2- 5 min3- 5 min、操作方法及步骤: 取材，未能固定的组织取材，不能
6、太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24x24x2mm。 取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其 冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。 将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在510um间。二、冰冻切片时的注意事项： 防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片 后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，
7、如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便 切片不能完整切出。 多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片， 这样做既不费时也不会乱。 放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的 效果。 组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固 定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰 晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份
8、也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中， 形成了冰晶。 当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或 者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。 用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的 切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分 子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度 相同，没有发生上述的现
9、象。三、冰冻切片的快速染色方法： 切片固定30秒一1分钟。 水洗。 染苏木素3-5分钟。 分化。 于碱水中返蓝20秒。 伊红染色10-20秒。 脱水，透明，中性树胶封固。冰冻组织1-2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切 片不相上下。冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯 乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不作阐述。常规方法:(1)冰冻切片固定1030 s(2)稍水洗12 s(3)苏木精液染色(60C)3060 s(4)流水洗去苏木精液5 10 s(5) 1%
10、盐酸乙醇13 s(6)稍水洗12 s(7)促蓝液返蓝510 s(8)流水冲洗1530 s(9) 0.5%曙红液染色3060 s(10)蒸馏水稍洗12 s(11)80%乙醇12 s(12)95%乙醇12 s(13)无水乙醇12 s(14)石炭酸二甲苯23 s(15)二甲苯(I)23 s(16)二甲苯(II)23 s(17 )中性树胶封固。注：第(14)步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇，染色结果为：细胞核蓝色、胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞 呈深浅不一的红色。封片 切片染色后封片常用中性树胶，酸性的树胶可使胞核褪色，如树胶放置时间过长，因氧化而变酸。中性树胶可用二 甲苯稀释。树胶过浓，封片时
11、容易导致气泡；过稀，封片时易使胶外溢，影响美观，也会出现由于二甲苯挥发后缺胶的现象。在整个染色过程中不让切片干涸：切片完全干涸，会使组织收缩和出现裂痕即出现所谓“龟裂”现象。也会使部分细胞核透明不良，看起来像黑色的细胞核，即形成“黑核”。囱一、HE染液的配制：1、Harris苏木素：称取 苏木素精 1g一氧化汞 0.5g硫酸铝钾 20g量取无水乙醇 10ml蒸馏水 200ml苏木素溶于无水乙醇，钾明矶溶于蒸馏水，二者混合后煮沸，离火，加入氧化汞，用玻棒搅拌，试剂变 为深紫色，立即移入冷水快速冷却，静置一夜，过滤，棕色小磨口试剂瓶密封保存。使用前加入5%冰乙酸 4ml （或冰乙酸3滴）。2、0.
12、5%伊红（水溶性）: 称取伊红 0.5g量取95%乙醇25ml蒸馏水 75ml先取少量蒸馏水加入伊红，用玻棒将伊红碾碎并搅溶，再加入全部蒸馏水，完全溶解后，再加入乙醇， 最后加入冰乙酸1滴。白色小磨口试剂瓶密封保存。3、1%盐酸水溶液：盐酸 3ml蒸馏水297ml混匀，白色试剂瓶保存。4、中性树胶封片剂：往125ml棕色滴瓶中倒入中性树胶若干，加入二甲苯适量用吸管调匀，有一定粘稠度即可。试剂：二甲苯 1瓶 Harris苏木素染液无水乙醇 2瓶1%盐酸水溶液95%乙醇 2瓶0.5%伊红（水溶性）染液中性树胶封片剂二、染色步骤1、电吹风吹片或烤片，至溶蜡；2、入二甲苯（I）中脱蜡5分钟，用吸水纸吸
13、干液体；3、入二甲苯（II）中脱蜡10分钟（切片透明），用吸水纸吸干液体；4、入100%乙醇（I）5分钟，用吸水纸吸干液体；5、入100%乙醇（II ）5分钟，用吸水纸吸干液体；6、入95%乙醇3分钟；7、入流水2分钟，用吸水纸吸干水分；8、Harris苏木素染色4一8分钟；9、自来水稍洗；10、1%盐酸水溶液分化510秒（切片由蓝变红）；11、自来水洗返蓝1530分钟；12、0.5%伊红（水溶性）染色30秒1分13、95%乙醇（I）脱水5分钟，用吸水纸吸干液体；14、95%乙醇（II ）5分钟，用吸水纸吸干液体；15、入100%乙醇（I） 5分钟，用吸水纸吸干液体；16、入100%乙醇（II
14、） 2分钟，用吸水纸吸干液体；17、入二甲苯（I）中透明2-3分钟，用吸水纸吸干液体；18、入二甲苯（II ）中透明5分钟；19、中性树胶封片。20、镜下观察结果：细胞核深蓝色，胞浆及纤维组织呈深浅不等的红色。三、注意事项1、苏木素染色时间应根据染液的新鲜或陈旧、及着色力决定。2、盐酸分化要恰当，分化不足，会核、浆共染，分化过度会造成核染色过浅。3、水洗蓝化时间应充分，以防褪色。4、封片后，玻片应及时贴上标签并写上编号。常规制片（H.E）染色程序ZT一、HE染液的配制：1、Harris苏木素：称取 苏木素精1g一氧化汞0.5 g硫酸铝钾 20g量取无水乙醇10ml蒸馏水 200ml苏木素溶于无
15、水乙醇，钾明矶溶于蒸馏水，二者混合后煮沸，离火，加入氧化汞，用玻棒搅拌，试剂变为 深紫色，立即移入冷水快速冷却，静置一夜，过滤，棕色小磨口试剂瓶密封保存。使用前加入5%冰乙酸 4ml （或冰乙酸3滴）。2、0.5%伊红（水溶性）: 称取伊红 0.5g量取95%乙醇25ml蒸馏水 75ml先取少量蒸馏水加入伊红，用玻棒将伊红碾碎并搅溶，再加入全部蒸馏水，完全溶解后，再加入乙醇，最 后加入冰乙酸1滴。白色小磨口试剂瓶密封保存。3、 1%盐酸水溶液：盐酸3ml蒸馏水297ml混匀，白色试剂瓶保存。4、中性树胶封片剂：往125ml棕色滴瓶中倒入中性树胶若干，加入二甲苯适量用吸管调匀，有一定粘稠度即可。试剂二甲苯 1瓶Harris苏木素染液无水乙醇 2瓶1%盐酸水溶液95%乙醇 2瓶0.5%伊
