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1、实验二 高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因一、目的要求1、学习高效液相色谱仪的操作。2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。二、基本原理/CHN咖啡因又称咖啡碱,是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱,它属黄嘌呤衍 生物,化学名称为 1,3,7-三甲基黄嘌呤。咖啡因能兴奋大脑皮层,使人精神兴奋。 咖啡中含咖啡因约为1.2T.8%,茶叶中约含2.04.7%。可乐饮料、APC药片等中 均含咖啡因。其分子式为c8h10o2n4,结构式为:3CH3定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱 法将饮料中的咖啡因与其它组分(如:
2、单宁酸、咖啡酸、蔗糖等)分离后,将已 配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整 个实验过程中是恒定的,测定它们在色谱图上的保留时间tR和峰面积A后,可直 接用tR定性,用峰面积A作为定量测定的参数,采用工作曲线法(即外标法)测 定饮料中的咖啡因含量。三、仪器和试剂1、Agilent 1100高效液相色谱仪。2、色谱柱:Kromasil C18, 5卩 150X4.6mm。3、流动相: 30%甲醇(色谱纯) +70%高纯水;流动相进入色谱系统前,用超声 波发生器脱气 10min。4、咖啡因标准贮备溶液:将咖啡因在110C下烘干lh。准确称取O.lOOOg咖啡 因,用
3、二次蒸馏水溶解,定量转移至 100mL 容量瓶中,并稀释至刻度。标样浓 度 1000pgmL -1。5、测饮料试液:可乐,茶叶,速溶咖啡。6、20卩L平头微量注射器。四、实验内容1、标准贮备液配制质量浓度分别为20、40、60、80 Ag-mL-1的标准系列溶液。(1mL,2mL,3mL、4mL 稀释为 50mL)2、谱仪器条件:泵的流速:1.0mL/min;检测波长:275nm;进样量:10;柱温:室温。3、仪器基线稳定后,进咖啡因标准样,浓度由低到高。4、品处理如下:(1)将约25mL可口可乐置于一 100mL洁净、干燥的烧杯 中,剧烈搅拌30min或用超声波脱气5min,以赶尽可乐中二氧
4、化碳。(2)准确 称取0.04g速溶咖啡,用90C蒸馏水溶解,冷却后待用。(3)准确称取0.04g茶 叶,用20mL蒸馏水煮沸10min,冷却后,将上层清液,并按此步骤再重复一次。 将上述三种样品分别转移至50mL容量瓶中,并定容至刻度。5、上述三份样品溶液分别进行干过滤(即用干漏斗、干滤纸过滤),弃去前 过滤液,取后面的过滤液,备用。6、别取5mL可乐、咖啡饮料和茶叶水用0.45ym的过滤膜过滤后,注入2mL 样品瓶中备用。7、“岛津LC-20AT高效液相色谱仪操作规程”分析饮料试液。五、结果处理1. 测定每一个标准样的保留时间(进样标记至色谱峰顶尖的时间)。2. 确定未知样中咖啡因的出峰时
5、间。3. 求取样品中咖啡因的浓度。记得实验结果如下:序号标样浓度UgmL-1保留时间tR色谱峰面积S色谱峰高度H1205.037706020416742405.0371297842711673605.0861737510962724805.07120737821106235茶叶5.1201646966943306百事可乐5.09821481241179647速溶咖啡5.18543157125125将标样的数据利用EXCEL软件绘图,并计算回归方程,如下:色谱峰面积Sy = 22715x + 318050 R2 = 0.9843将茶叶、百事可乐、速溶咖啡测试所得的峰面积代入回归方程计算浓度:标
6、样色谱峰面积S浓度AgmL-1茶叶164696658.5039百事可乐214812480.56676速溶咖啡4315714.997623六、注意事项1、不同的可乐、茶叶、咖啡中咖啡因含量不大相同,称取的样品量可酌量增减2、若样品和标准溶液需保存,应置于冰箱中。3、为获得良好结果,标准和样品的进样量要严格保持一致。七、思考题1、用标准曲线法定量的优缺点是什么?答:标准曲线法的优点是:绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简单, 可直接从标准工作曲线上读出含量,因此特别适合于大量样品的分析。标准曲线法的缺点是:每次样品分析的色谱条件(检测器的响应性能,柱温, 流动相流速及组成,进样量,柱效等)很难
7、完全相同,因此容易出现较大误差。 此外,标准工作曲线绘制时,一般使用欲测组分的标准样品(或已知准确含量的 样品),而实际样品的组成却千差万别,因此必将给测量带来一定的误差。2、根据结构式,咖啡因能用离子交换色谱法分析吗?为什么?答:不行。因为离子交换色谱以离子交换树脂作为固定相,树脂上具有固定 离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相 时,组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。平衡常数 K 值越大,表 示组分的离子与离子交换树脂的相互作用越强。由于不同的物质在溶剂中离解 后,对离子交换中心具有不同的亲合力,因此具有不同的平衡常数。亲合力大的, 在柱中的停留时间长,具有高的保留值。依据咖啡因的结构式 1,3,7-三甲基黄嘌 吟或3,7-二氢-1,3,7三甲基-1H-嘌吟-2,6-二酮,其解离常数很小,不符合离子交换 色谱的要求。4、在样品干过滤时,为什么要弃去前过滤液?这样做会不会影响实验结 果?为什么?答:干过滤主要是保持溶液浓度不变而采取的一种过滤方法,前液中可能有 一些滤纸或滤膜上的杂质存在,为了保持溶液浓度不变,所以要将前液去掉。干 过滤为分离掉溶液中的固体,并且不改变溶液浓度而采取的一种方法。为保持溶 液浓度不变。前段滤液要弃去,并且滤纸漏斗盛接的烧杯都要干的。这样做不会 影响实验结果。