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1、实验二 高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因一、目的要求1、学习高效液相色谱仪的操作。2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。二、基本原理/CHN咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍 生物，化学名称为 1,3,7-三甲基黄嘌呤。咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。 咖啡中含咖啡因约为1.2T.8%,茶叶中约含2.04.7%。可乐饮料、APC药片等中 均含咖啡因。其分子式为c8h10o2n4，结构式为：3CH3定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱 法将饮料中的咖啡因与其它组分（如：
2、单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已 配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整 个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间tR和峰面积A后，可直 接用tR定性，用峰面积A作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测 定饮料中的咖啡因含量。三、仪器和试剂1、Agilent 1100高效液相色谱仪。2、色谱柱：Kromasil C18， 5卩 150X4.6mm。3、流动相： 30%甲醇（色谱纯） +70%高纯水；流动相进入色谱系统前，用超声 波发生器脱气 10min。4、咖啡因标准贮备溶液：将咖啡因在110C下烘干lh。准确称取O.lOOOg咖啡 因，用
3、二次蒸馏水溶解，定量转移至 100mL 容量瓶中，并稀释至刻度。标样浓 度 1000pgmL -1。5、测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。6、20卩L平头微量注射器。四、实验内容1、标准贮备液配制质量浓度分别为20、40、60、80 Ag-mL-1的标准系列溶液。（1mL，2mL，3mL、4mL 稀释为 50mL）2、谱仪器条件：泵的流速：1.0mL/min；检测波长：275nm；进样量：10；柱温：室温。3、仪器基线稳定后，进咖啡因标准样，浓度由低到高。4、品处理如下：（1）将约25mL可口可乐置于一 100mL洁净、干燥的烧杯 中，剧烈搅拌30min或用超声波脱气5min,以赶尽可乐中二氧
4、化碳。（2）准确 称取0.04g速溶咖啡，用90C蒸馏水溶解，冷却后待用。（3）准确称取0.04g茶 叶，用20mL蒸馏水煮沸10min,冷却后，将上层清液，并按此步骤再重复一次。 将上述三种样品分别转移至50mL容量瓶中，并定容至刻度。5、上述三份样品溶液分别进行干过滤（即用干漏斗、干滤纸过滤），弃去前 过滤液，取后面的过滤液，备用。6、别取5mL可乐、咖啡饮料和茶叶水用0.45ym的过滤膜过滤后，注入2mL 样品瓶中备用。7、“岛津LC-20AT高效液相色谱仪操作规程”分析饮料试液。五、结果处理1. 测定每一个标准样的保留时间（进样标记至色谱峰顶尖的时间）。2. 确定未知样中咖啡因的出峰时
5、间。3. 求取样品中咖啡因的浓度。记得实验结果如下：序号标样浓度UgmL-1保留时间tR色谱峰面积S色谱峰高度H1205.037706020416742405.0371297842711673605.0861737510962724805.07120737821106235茶叶5.1201646966943306百事可乐5.09821481241179647速溶咖啡5.18543157125125将标样的数据利用EXCEL软件绘图，并计算回归方程，如下:色谱峰面积Sy = 22715x + 318050 R2 = 0.9843将茶叶、百事可乐、速溶咖啡测试所得的峰面积代入回归方程计算浓度：标
6、样色谱峰面积S浓度AgmL-1茶叶164696658.5039百事可乐214812480.56676速溶咖啡4315714.997623六、注意事项1、不同的可乐、茶叶、咖啡中咖啡因含量不大相同，称取的样品量可酌量增减2、若样品和标准溶液需保存，应置于冰箱中。3、为获得良好结果，标准和样品的进样量要严格保持一致。七、思考题1、用标准曲线法定量的优缺点是什么？答：标准曲线法的优点是：绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简单， 可直接从标准工作曲线上读出含量，因此特别适合于大量样品的分析。标准曲线法的缺点是：每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能，柱温， 流动相流速及组成，进样量，柱效等）很难
7、完全相同，因此容易出现较大误差。 此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的 样品），而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。2、根据结构式，咖啡因能用离子交换色谱法分析吗？为什么？答：不行。因为离子交换色谱以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定 离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相 时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。平衡常数 K 值越大，表 示组分的离子与离子交换树脂的相互作用越强。由于不同的物质在溶剂中离解 后，对离子交换中心具有不同的亲合力，因此具有不同的平衡常数。亲合力大的， 在柱中的停留时间长，具有高的保留值。依据咖啡因的结构式 1,3,7-三甲基黄嘌 吟或3,7-二氢-1,3,7三甲基-1H-嘌吟-2,6-二酮，其解离常数很小，不符合离子交换 色谱的要求。4、在样品干过滤时，为什么要弃去前过滤液？这样做会不会影响实验结 果？为什么？答：干过滤主要是保持溶液浓度不变而采取的一种过滤方法，前液中可能有 一些滤纸或滤膜上的杂质存在，为了保持溶液浓度不变，所以要将前液去掉。干 过滤为分离掉溶液中的固体,并且不改变溶液浓度而采取的一种方法。为保持溶 液浓度不变。前段滤液要弃去，并且滤纸漏斗盛接的烧杯都要干的。这样做不会 影响实验结果。
