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1、水稻种子萌发后淀粉酶活力的测定【实验原理】种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉酶分解为麦芽糖：2（C6H10O5）n+nH2O nC12H22O11 淀粉 麦芽糖麦芽糖有还原性，能使3,5-二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸：产物3-氨基-5硝基水杨酸呈棕色，可用分光光度计测定。休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸账萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数的增长而增加。【仪器、材料与试剂】（一） 仪器分光光度计、离心机、恒温箱、恒温水浴锅、25mL刻度试管、乳钵、离心管（二） 材料水稻种子、芽糖、淀粉、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、细砂、磷酸二氢钾（KH2PO4）、
2、磷酸氢二钠（Na2HPO4）、氯化钠（NaCl）、氢氧化钠（NaOH）（三） 试剂1.1g/L标准麦芽糖溶液 20mL精确称量100mg麦芽糖，用少量水溶解后，移入100mL量瓶中，用蒸馏水定容。2.0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.9） 100mL推荐精选0.2mol/L磷酸二氢钾67.5mL与0.02mol/L磷酸氢二钾82.5mL混合，稀释10倍。3.10g/L淀粉溶液 100mL1g可溶性淀粉溶于100mL0.02mol/L磷酸盐缓冲液中，其中含有0.0067mol/L氯化钠。4.10g/L3,5-二硝基水杨酸试剂 100mL1g3,5-二硝基水杨酸溶于20mL2mol/L的氢氧
3、化钠溶液和50mL水中，再加入30g酒石酸钾钠，定容至100mL。若溶液浑浊，可以过滤。5.10g/L氯化钠溶液 300mL6.细砂 5g【实验步骤】1. 种子发芽种子浸泡处理后，放入培养皿中在人工气候室内发芽。2. 酶液提取取发芽4天左右的幼苗15株，放入乳钵内，加入细砂200mg，加10g/L氯化钠溶液10mL，用力磨碎。在室温下放置20min，搅拌几次。然后将提取液1500r/min离心6-7min。将上清液倒入量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时，用缓冲液将酶提取液稀释10倍。另取未萌发的水稻种子15粒作为对照（提取步骤同上）。3. 酶活力测定（1） 取25mL刻度试管8支，编
4、号。按下表要求加入各试剂（各试剂须要在25预热10min）。 试管标号 试剂12345种颜色照射下发芽种子的酶提取液各一支（红色、绿色、黄色、白色、黑色）未萌发种子的酶的提取液标准管空白管酶液/mL0.50.5标准麦芽糖溶液/mL0.510g/L淀粉溶液/mL1.01.01.01.0水/mL0.5将各管混匀，放在25水浴中，保温3min后立即向各管中加入100g/L3,5-二硝基水杨酸溶液2mL。（3）取出各试管，放入沸水浴中加热5min。冷却至室温加水稀释至25mL。将各管充分混匀。推荐精选（4）用空白管作对照，在500nm处测定各管的吸光度值。【实验结果】1.将500nm波长处读取的数值填
5、入下表：试管号15种颜色照射下发芽种子的酶提取液各一支（红色、绿色、黄色、白色、黑色）2未萌发种子的酶的提取液3标准4空白A500nm2. 关于麦芽糖浓度的计算根据溶液的浓度与吸光度值成正比的关系，即：，则c（酶液管中麦芽糖的浓度）=式中，c为浓度；A为吸光度值。规定：25时3min内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位。则15粒种子的 总活力单位=式中，为酶液中麦芽糖的浓度；为酶液稀释倍数；为提取酶液的总体积。水稻种子萌发后可溶性糖的测定【实验原理】糖类遇浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物，反应如下：推荐精选糠醛或羟甲基糠醛进一步与蒽酮试剂缩合产生蓝绿色物质，其在可见光区620nm波
6、长处有最大吸收，且其光吸收值在一定范围内与糖的含量成正比关系。此法可用于单糖、寡糖和多糖的含量测定，并具有灵敏度高，简便快捷，适用于微量样品的测定等优点。【实验材料、仪器及试剂】（一） 材料培养4天左右的水稻种子、未萌发的水稻种子（二） 仪器分光光度计、恒温水箱、20mL试管（3支）、漏斗、100mL容量瓶、刻度试管、试管架、研钵（三）试剂：（1）100g/mL标准葡萄糖：AR级葡萄糖100mg，蒸馏水溶解，定容至1000mL。（2）蒽酮试剂：0.2g蒽酮，溶于100mL浓硫酸中。当日配制使用。棕色瓶避光处贮藏。（3）浓硫酸。【实验步骤】1.葡萄糖标准曲线的制作取7支20mL试管，编号，按下表
7、数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。推荐精选在每管中均加入4mL蒽酮试剂，迅速浸于冰水浴中冷却，各管完成后一起浸于沸水浴中，管口加盖，以防蒸发。置沸水浴中煮沸10min，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的光密度值（OD），以标准葡萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。管号1234567标准葡萄糖原液（mL）（100g/mL）00.20.30.40.50.60.8蒸馏水1.00.80.70.60.50.40.2葡萄糖含量（g）02030405060802.样品中可溶性糖的提取称取1g发芽种子，置于研钵中，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆，然后转入试管中，用10mL蒸馏
8、水分次洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。置沸水浴中加盖煮沸10分钟，冷却后过滤，滤液收集于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。其余4种颜色照射下发芽种子的提取液各一份，提取步骤同上。（红色、绿色、黄色、白色、黑色）3.糖含量测定用移液管吸收1mL提取液于试管中，加入4.0mL蒽酮试剂。盖上试管塞后，轻轻摇匀，再置沸水浴中10min（比色空白用1mL蒸馏水与4.0mL蒽酮试剂混合，并一同于沸水浴保温10min）。冷却至室温后，在波长620nm下比色，记录光密度值。查标准曲线上得知对应的葡萄糖含量（g）。【结果计算】样品含糖量（g/100g鲜重）=100水稻种子的蛋白酶活性测定【实验
9、材料】水稻种子（萌发、未萌发）各浓度酪氨酸溶液（10-60）磷酸缓冲液（pH=7.8）：磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）0.5g, 加水溶解定容至1000mL,pH计校正;推荐精选0.4mol/L三氯乙酸溶液：称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL;1%酪蛋白溶液：称取酪蛋白1.000g，精确至0.001g，用1020mL 0.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加入磷酸缓冲液约60mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后转入100mL容量瓶中，用磷酸缓冲液定容，此溶液在4保存，有效期为三天；福林试剂：于1000ml的圆
10、底烧瓶中，加入20g钨酸钠（），5g钼酸钠（）和140ml蒸馏水，再加入10ml85%磷酸（）及20ml浓盐酸，充分混合，加入沸石防暴沸。使用回流装置微沸2h，回流结束及冷却后，加入300g硫酸锂（），10ml蒸馏水及2-3滴溴，在通风橱内加热煮沸15min（不必回流），驱除过量的溴。冷却后加蒸馏水到200ml，过滤，保存于玻塞棕色瓶中备用。所制成的试剂应为淡黄色而不带绿色。使用前用标准NaOH滴定（酚酞做指示剂），算出酸的浓度。然后适当稀释，约加水一倍，使最终的酸浓度为1mol/L左右。【实验步骤】 1.样品的采集与处理:分别取两种水稻种子10粒于研钵中,加入少许石英砂以及2 mL 0.1
11、mol/L、pH7.8的磷酸缓冲液研碎,经研磨至匀浆状态,再加入3 mL同样的磷酸缓冲液,继续研磨至匀浆,此为酶液,备用。磷酸盐缓冲液稀释3倍后备用。2.绘制标准曲线取不同浓度酪氨酸（10-60）酪氨酸溶液各1ml，分别加入0.5mol/L碳酸钠溶液5ml，福林试剂1ml，置于28恒温水浴中显色15min，用空白管（只加水、碳酸钠溶液和福林试剂）做对照，利用分光光度计在680nm处测吸光度值，以吸光度值为纵坐标，以酪氨酸质量为横坐标，绘制标准曲线（做两组及以上平行试验以保证准确性）。3.酶活性测定吸取1%酪蛋白溶液2ml置于试管中，在28水浴中预热5min后加入预热（28水浴5min）的酶液1
12、ml，立即计时。反应10min后，由水浴中取出，并立即加入0.4mol/L三氯乙酸溶液3ml，放置15min后，用滤纸过滤。同时另做一对照管，即取酶液1ml先加入3ml0.4mol/L三氯乙酸溶液，然后再加入1%酪蛋白溶液2ml。28水浴保温10min，放置15min，过滤。取三支已经编号的试管，分别加入样品滤液、对照滤液和水各1ml。然后加入0.5mol/L碳酸钠溶液5ml，混匀后再各加入福林试剂1ml，立即混匀，在28显色15min。以加水管为空白，在680nm处测对照及样品的吸光度值。计算酶活力：规定在28，pH7.8的条件下，水解酪蛋白每分钟产生酪氨酸为一个活力单位，则水稻种子蛋白酶在
13、28，pH7.8的条件下所具有的活力单位为：推荐精选式中，为样品液吸光度值；为対照液吸光度值；K为标准曲线上吸光度值为1时的酪氨酸质量（）；t为酶促反应的时间（min），本次t=10min；V为酶促反应管的总体积（ml），本次实验V=未定；N为酶液的稀释倍数，本实验N=2000（可适当调整）。4.种子活力的测定逐日统计发芽率,7 d后将幼苗烘干称重,取其单株幼苗的平均干重,计算发芽指数和活力指数。发芽指数= / (是t时间内的发芽数,是相应的发芽天数);活力指数=发芽指数幼苗干重。光质发芽率（%）发芽指数幼苗干重（mg）活力指数白光红光绿光黄光无光发芽率发芽势发芽指数发芽势是指在发芽过程中日发芽种子数达到最高峰时，发芽的种子数占供测样品种子数的百分率，一般以发芽试验规定期限的最初1/3期间内的种子发芽数占供验种子数的百分比为标准。发芽指数是指种子在失去发芽力之前已发生劣变的数量。发芽指数（GI）= （Gt/Dt）Dt发芽日数，Gt与Dt相对应的每天发芽种子数与发芽日数。 （注：可编辑下载，若有不当之处，请指正，谢谢!） 推荐精选
