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1、无菌操作原则2008-6-23 15:4 【大中小】【我要纠错1、环境要清洁，进行无菌操作前半小时，须停止清扫地面等工作。避免不必要的人群 流动，防止尘埃飞扬。治疗室应每天用紫外线消毒一次。2、进行无菌操作时，衣帽穿戴要整洁。帽子要把全部头发遮盖，口罩须遮住口鼻，并 修剪指甲、洗手。3、无菌物品与非无菌物品应分别放置。无菌物品不可暴露在空气中，必须放于无菌包 或无菌容器内，无菌物品一经使用后，必须再经灭菌处理后方可使用。从无菌容器中取出的 无菌物品，虽未使用，也不可放回无菌容器内。4、无菌包应注明物品的名称、消毒灭菌日期，并按日期先后顺序排放，以便取用，放 在固定的地方。无菌包在未污染的情况下
2、，可保存7-14天，过期应重新灭菌。5、取无菌物品时，必须用无菌持物钳（镊）。未经消毒的用物不可触及无菌物或跨越无 菌区。6、进行无菌操作时，如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用，应更换或重新 灭菌。7、一份无菌物品，只能供一个病员使用，以免发生交叉感染。无菌操作注意事项：1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台（laminar flow）以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70 % ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每 次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间 污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以7
3、0 % ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间 隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等 可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol擦 拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操 作。3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在 打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45角取用， 尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。4. 工作人员应注意自身之安全
4、，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病 毒 感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台（至少Class II）。操作过程 中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。5. 定期检测下列项目：5.1. CO2钢瓶之CO2压力5.2. CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）。5.3. 无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网（300小时/预滤网，3000小时/HEPA）。6. 水槽可添加消毒剂（Zephrin 1:750），定期更换水槽的水植物
5、外植体消毒和接种：用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。在组织培养中，外植体如果是带菌的， 在接种前都必须进行表面消毒，这是取得培养成功的最基本的和重要的前提。常用消毒剂对 外植体进行消毒。从室外取的材料，一般先用自来水冲洗数分钟，对表面不光滑或长有绒毛 等结构不容易洗净的材料，自来水冲洗的时间要长，几个小时或过夜，并且用洗衣粉或洗洁 精洗涤，必要时用毛刷刷洗。洗后的材料用滤纸擦干，然后浸泡在消毒溶液中。接种材料使 用消毒剂后，要用无菌水洗涤35遍，最后用无菌纸擦干净。使用消毒剂的原则是既要达 到消毒目的，又不能损伤植物组织和细胞，还要符合就地取材的原则。对一些容易污染、较 难灭菌的外
6、植体进行表面消毒时，用单一消毒剂不能收到好的效果，所以常选用两种消毒剂 交替浸泡法。一般，首先用75%乙醇浸泡外植体数秒钟至30s，然后置于0.1 %氯化汞溶液5 10min或含有2%活性氧的次氯酸钠溶液530min，然后用无菌水洗涤。有时在氯化汞或 次氯酸钠灭菌后，用无菌水洗，进一步剥去几层组织或器官如叶片后，再用次氯酸钠灭菌3 5min，无菌水漂洗3次后，切割、用于接种。用消毒剂对接种材料进行灭菌处理时，可以在灭菌溶液中加入12滴表面活性剂，如吐温 80或吐温20，它们可以湿润外植体整个组织，促进灭菌液充分接触表面组织，达到较好的 消毒效果。有时还可以用磁力搅拌、超声振动等方法使消毒杀菌剂
7、进入外植体。消毒溶液对 外植体消毒是在超净工作台上进行。完成表面消毒的接种材料要尽快放置于培养基中。植物外植体消毒和接种（以胡萝卜为例）：1 .接种前，用75 %乙醇棉球或用2%苯扎漠铵溶液擦拭超净工作台台面，将培养基及用 具放入工作台，开超净工作台紫外灯照射至少20 min，然后开送风开关，之后关闭紫外灯， 通风10 min后，再开日光灯进行无菌操作。2 .将胡萝卜块根在自来水下冲洗干净，用小刀切去外围组织，切成小块分别放00 mL烧 杯中，用75%乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1%氯化汞溶液分别浸泡2、5、10 min，用无 菌水洗涤3次，无菌纸吸干水分。取出培养皿，剪刀和镊子使用前插入9
8、0%乙醇溶液中， 使用镊子时在酒精灯火焰上炽烧片刻，冷却后，切取髓部组织0.5cm。以上操作都要在试 管口靠近火焰旁。3 .将培养容器斜面向上，并使它们拉于水平位置，也可将培养容器放在左手中。将塞盖 用右手拧转松动，以便接种时拔出。用火焰灼烧管口，灼烧时应不断转动试管口（靠手腕的 动作，使试管口沾染的少量菌得以烧死）。将烧过的接种针（环）触动培养基部分，使其冷 却，以免烧死被接种的外植体，然后轻轻接触外植体，慢慢将接种针（环）抽出试管，打开 培养容器盖，将外植体放在培养基上，每瓶放3块。封口，贴标签，注明姓名，标明时间 和材料名称。整理好接种室（箱）的台面，搞好清洁卫生。4 .用水洗干净非洲澎
9、蜞菊叶片，用滤纸擦干后置于100 mL烧杯中，在超净工作台上加入 75%乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1%氯化汞溶液浸泡3、5、7 min，用无菌水洗涤3次， 将叶片切成长1cm，按照上述同样的步骤接种于培养基上。5 .绿豆种子用75%乙醇溶液浸泡30 s，然后用0.1%氯化汞溶液（加入吐温2滴）浸泡3、 5、10 min，期间不断搅拌溶液，用无菌水洗涤56遍，洗干种子外围水分，按照上述 同样的步骤接种于培养基上。无菌操作原则：一、在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区。二、执行无菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并将手擦干，注意空气和环境清洁。三、夹取无菌物品，必须使用无菌持物钳。无
10、菌操作间无菌操作间四、进行无菌操作时，凡未经消毒的手、臂、均不可直接接触无菌物品或超过无菌区取物。五、无菌物品必须保存在无菌包或灭菌容器内，不可暴露在空气中过久。无菌物与非无 菌物应分别放置。无菌包一经打开即不能视为绝对无菌，应尽早使用。凡已取出的无菌物品 虽未使用也不可再放回无菌容器内。六、无菌包应按消毒日期顺序放置在固定的柜橱内，并保持清洁干燥，与非灭菌包分开 放置，并经常检查无菌包或容器是否过期，其中用物是否适量。七、无菌盐水及酒精、新洁尔灭棉球罐每周消毒一次，容器内敷料如干棉球、纱布块等， 不可装得过满，以免取用时碰在容器外面被污染。原则及注意事项无菌操作原则：一、在执行无菌操作时，必
11、须明确物品的无菌区和非无菌区。二、执行无菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并将手擦干，注意空气和环境清洁。三、夹取无菌物品，必须使用无菌持物钳。无菌操作间四、进行无菌操作时，凡未经消毒的手、臂、均不可直接接触无菌物品或超过无菌区取物。五、无菌物品必须保存在无菌包或灭菌容器内，不可暴露在空气中过久。无菌物与非无菌物应分别放置。无菌包一经打开即不能视为绝对无菌，应尽早使用。凡已取出的无菌物品虽未 使用也不可再放回无菌容器内。六、无菌包应按消毒日期顺序放置在固定的柜橱内，并保持清洁干燥，与非灭菌包分开放置，并经常检查无菌包或容器是否过期，其中用物是否 适量。七、无菌盐水及酒精、新洁尔灭棉球罐每周消毒一
12、次，容器内敷料如干棉球、纱布块等，不可装得过满，以免取用时碰在容器外面被污染。无菌操作技术及注意事项1、玻璃器皿的消毒和清洁新购玻璃器皿的处理新购玻璃器皿应用热肥皂水洗刷，流水冲洗，再用1%2%盐酸溶液浸泡，以除去游离碱，再用水冲洗。对容量较大的器 皿如试剂瓶、烧瓶或量具等，经清水洗净后应注入浓盐酸少许，慢慢转动，使盐酸布满容器 内壁数分钟后倾出盐酸，再用水冲洗。污染玻璃器皿的处理一般试管或容器可用3%煤酚皂溶液或5%石炭酸浸泡，再煮沸30分钟，或在3%5%漂白粉澄清液内4小 时，有的亦可用肥皂或合成洗涤剂洗刷使尽量产生泡沫，然后用清水冲洗至无肥皂为止。最 后用少量蒸馏水冲洗。细菌培养用的试管
13、和培养皿可先行集中，用1kg/cm2高压灭菌1530分钟，再用热水洗涤后，用肥皂洗刷，流水冲洗。吸管使用后应集中于3%煤酚皂溶液中浸泡24小时，逐支用流水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗。油蜡沾污的器皿，应单独灭菌洗涤，先将沾有油污的物质弃去，倒置于吸水纸上，100C烘干半小时， 再用碱水煮沸，肥皂洗涤，流水冲洗。必要时可用二甲苯或汽油去油污。染料沾污的器皿，可先用水冲洗，后用清洁或稀盐酸洗脱染料，再用清水冲洗。一般染色剂呈碱性， 所以不宜用肥皂的碱水洗涤。玻片可置于3%煤酚皂溶液中浸泡，取出后流水冲洗，再用肥皂或弱碱性煮沸，自然冷却后，流水冲洗。被结核杆菌污染或不易洗净的玻片，可置 于清洁液内浸泡后
14、再冲洗。2、无菌器材和液体的准备将玻璃器具中的培养皿、培养瓶、试管、吸管等按上述方法洗净烘干后，用一洁净纸包好瓶口并把吸管尾端塞上棉花，装入干 净的铝盒或铁盒中，于120C的干燥箱中干燥灭菌2小时，取出备用。对于手术器械、瓶塞、 工作服以及新配制的PBS洗液，则采用高压蒸气灭菌法，即在15磅的条件下，加热20分 钟。而对于MEM培养液、小牛血清和消化液等需用G5或G6滤器负压抽滤后使用。3、无菌操作过程在无菌操作过程中，最重要的是要保持工作区的无菌、清洁。因此，在操作前 2030分钟要先启动超净台和紫外灯，并认真洗手和消毒。在操作时，严禁喧哗，严禁用 手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的
15、止血钳、镊子等。培养瓶应在超净台内操作， 并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。对于吸管应先用手拿后1/3处，戴上胶皮乳头， 并用酒精灯烧烤之后再吸液体。4、常用清洁液的配制法重格酸钾清洁液：可根据不同需要，选用下列的任何一种浓度。先将重格酸钾溶于水中，再慢慢加入浓硫酸。注意，此时可产生高热，应防止容器破裂。重格酸钾清洁液除污力强，腐蚀性大，应避免接触皮肤和 衣服。为防止吸收空气的水分而变质，此液应贮存于带盖的容器中。如清洁效力较差，可再 加入少量重格酸钾及浓硫酸，还可继续使用。直到液体变蓝绿色，即不能再用。配制重格酸 钾清洁液时，宜用耐高温的陶瓷缸或耐酸搪瓷或塑料容器。使用玻璃器皿时，应特别注意防 止产生高热而破裂，切忌用量筒来配制。磷酸三钠将其配成5%10%水溶液，可用于洗涤玻璃器皿上的油污，但经常使用腐蚀玻璃，使器皿表面模糊、毛糙。硝酸清洁液将其配成50%水溶液，可用于清洁微量滴定筒。乙二胺四乙酸二钠（EDTA钠盐） 将其配成5%10%水溶液，可洗脱粘附于玻璃器皿内壁的白色沉淀物。尿素溶液尿素是 溶解蛋白质的良好溶剂，适用于洗涤粘附有血液血清等蛋白质的吸管、试管等。无菌操作法2007-10-24 17:23 【大 中 小】【我要纠错无菌操作法，是整个过程控制在无菌条件下进行的一种操作方法。某些药品加热灭菌后 发生变质、变色或降低含量者可采用无菌操作法制备。
