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1、细胞培养常见问题及其解决1. 如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在 MEM 中培养的细胞，很可能在 DMEM 或 M199 中 同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开 始。2. 何时须更换培养基？视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件 不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。血清是细胞培
2、养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产 生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使 用错误常会造成细胞无法存活。5 何谓 FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum)和FCS (fetal calf serum)是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃 错误的使用字眼， 请不要再使用。 CS (calf serum) 则是指小牛血清。 HS (horseserum) 则是指马 血清。6培养细胞时应使用5 %或10% CO2?或根本没有影响？一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-
3、/H+ 作为 pH 的缓冲系统， 而培养基中 NaHCO3 的含量 将决定细胞培养时应使用的 CO2 浓度。当培养基中 NaHCO3 含量为每公升 3.7 g 时，细胞培养 时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5 % CO2培养细胞。7Hanks平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？ Hanks平衡 盐溶液(HBS)和Earles平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？HBS和EBS的主要差别在于碳酸氢钠的水平，在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L)中高。 碳酸氢钠需用高水平的 CO2 平衡
4、，以维持溶液的 PH 值。 Eagles 液在空气水平的 CO2 中，溶液 会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles 液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。8. 细胞之接种密度为何？ 依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造 成细胞无法生长之一重要原因。9. 悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将 培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培 养角
5、瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。10. 冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入37 C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，并 注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须 注意安全， 预防冷冻管之爆裂。11. 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除 DMSO？除少数特别注明对 DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞)， 在解冻之后， 应直接放入含有 10-15ml 新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即 可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。1
6、2. 附着性细胞继代时所使用之 trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？一般使用之trypsin-EDTA浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分 装于无菌试管中，保存于-0 C，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染 之机会。13. 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞， 其离心速率一般为 300xg (约 1,000rpm)， 5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造 成细胞死亡。14. 细胞冷冻培养基之成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dim
7、ethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于 DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不 可将 DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。15. DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之DMSO等级，必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本 身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于 4C， 避免反复冷冻 解冻造成 DMSO 之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤 DMSO， 则须使用耐 DMSO 之 Nylon 材质滤膜。
8、16. 冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一：冷冻管置于4 C 3060分钟（-20 C30分钟*） -80 C 1618小时（或隔夜） f液氮槽vaporphase长期储存。冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 C至-80 C以下，再 放入液氮槽 vapor phase 长期储存。 *-20 C 不可超过 1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量 死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。17. 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1 x 1 06 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以 5x106
9、 cells/ml vial 为宜。18. 培养基中是否须添加抗生素？除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。19. 应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不 当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质 良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。20. 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？原则上：直接灭菌后丢弃之。当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原 体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消
10、毒剂消毒培养器皿和超净台，检查 HEPA 过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉 菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。 下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。1. 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。2. 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加 入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。3. 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下
11、降和变圆。4确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度23倍浓度的抗生素的培养液培养细胞23代。5. 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。6. 重复步骤 4。7在无抗生素的培养基中培养46代，确定污染是否以已被消除。21支原体（mycoplasma）污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。22支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确 认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。23. 侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？直接灭菌
12、后丢弃，以避免污染其它细胞株。24. CO2培养箱之水盘如何保持清洁？定期（至少每两周一次） 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。25为何培养基保存于4 C冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？培养基保存于4 C冰箱中，培养基内之CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养 基中之酸碱指示剂（通常为 phenol red） 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH值。26. 各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？不同厂牌的 dish 或 flask， 其所 coating 的 pol
13、ymer 不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞 没有太大之影响， 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之 dish 或 flask 而有显著之生长差异。27. 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少， 大都是因为离心过程操作上的失误， 造成细 胞的物理性损伤， 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心， 应待细胞生长隔夜后再更换 培养基即可。28. 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？ 研究人员在细胞培养时出现存活率不佳， 常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不 佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后
14、， 加以洗涤细胞和离心。 悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于-0 C太久。30. L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与 蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直 没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。31. GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定？GlutaMAX-I二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种 肽酶逐
15、渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解， 如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。32. 什么培养基中可以省去加酚红？酚红在培养基中用作 PH 值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明， 酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺 乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不 使用加有酚红的培养基。33. 如何用台盼兰计数活细胞？用无血清培养基把细胞悬液稀释到2002000个/毫升，在0.
16、1毫升细胞悬液中加0.1毫升0.4% 的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝 色细胞是死细胞。34. 培养基中丙酮酸钠的作用是什么？丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没 有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。35二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白 酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离 子。36室温下配制的Tris-HCl溶液，在37C使用时PH值是多少？
