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1、生化分析仪常用分析方法共有三大类，分别为终点法固定时间法和动力学法终点法： 指通过一段时刻的反应，反应达到平稳，由于反应的平稳常数专门大，可 认为全部底物（被测物）转变成产物，反应液的吸光度不再变化，只与被测物的浓度 有关。这类方法通常称为终点法，更确切地说应称平稳法。单试剂单波长终点法：tl时刻加入试剂体积为Vt2刻加入样本体积为S然后搅拌并反应，之后开始测量反应液的吸光度，在t3时刻反应达到终点，t3-t2为测定时刻。反应度 R=At3-At2-1XV/(V+S)，或 R=At3ARBLK。其中：Ati为i时刻的吸光度，ARBLK为试剂空白吸光度。单试剂双波长终点法： 差不多上同单试剂单波
2、长终点法，只是关于每一个测定 周期，事实上际吸光度等于A入1A入2。双 试 剂 单 波 长 终 点 法 ： tl 时 刻 加 入 第 一 试 剂 （ 体 积 为 Vl） ， t2 时 刻 加 入样本（体积为S）之后赶忙搅拌，t3时刻加入第二试剂（体积为V2）并赶忙搅拌，t4时刻反应达到终点。t3-t2为孵育时刻,t4-t 3为测定时刻。在项目参数中，假如反应起始时刻设为0那么反应度R=A时刻吸光度-双试剂空白 吸光度。 假如反应起始时刻小于0,那么反应度R=At4 -双试剂空白吸光度-t3到t2 间设定点的吸光度x （V1+S/（V1+S+V2）。双试剂双波长终点法： 差不多上同双试剂单波长终
3、点法，只是关于每一个测定 周期，事实上际吸光度等于A入1A入2。固定时刻法：又称为一级动力学法、二点动力学法等，指在一定的反应时刻内，反 应速度与底物浓度的一次方成正比，即v=kS。由于底物在不断的消耗，因此整个 反应速度在不断的减小，表现为吸光度的变化越来越小。这类反应达到平稳的时刻 专门长，理论上能够在任意时刻段进行监测，但由于血清成份复杂，反应刚启动时 反应较复杂，杂反应较多，必需通过一段延迟时刻才能进入稳固反应期。tl时刻加入试剂（体积为V）,之后测量试剂空白的吸光度，t2时刻加入样本（体积为S）, t3时刻反应稳固，t4时刻停止对反应进行监测；t2 13为延迟时刻，t3-t4为测定时
4、 刻 。单 波 长 反 应 度 单 双 试 剂 相 同 ：R=At4At3双波长反应度：R=t4时刻主波长吸光度一t4时刻次波长吸光度-一t3时刻主波长吸光度一給时刻次波长吸光 度动力学法：又称零级动力学法，指反应速度与底物浓度的零次方成正比，也确实是 与底物浓度无关。因此，在整个反应过程中，反应物能够匀速地生成某个产物，导 致被测定溶液在某一波长下吸光度平均地减小或增加，减小或增加的速度（AA/min） 与被测物的活性或浓度成正比。动力学法也被称为连续监测法；要紧用于酶活性的 测定。实际上，由于底物浓度不可能足够大，随着反应的进行，底物消耗到一定 程度后，反应速度不再为零级，因此，零级动力学
5、法是针关于特定时刻段而言的； 同样，由于血清成份复杂，反应刚启动时反应较复杂，杂反应较多，必需通过一段 延迟时刻才能进入稳固反应期，各试剂商对这两段时刻有严格规定。tl时刻加入试剂（体积为V）, t2时刻加入样本（体积为S）, t3时刻反应稳固，tn时刻停 止对反应进行监测；t3-t2为延迟时刻，tn-t3为测定时刻。单波长反应度单双试剂相同R=（nEATEAET） / n刀T2刀T2，其中：n = t3到tn间的数据个 数，T =时刻，A=某一时刻的吸光度。双波长反应度差不多同单波长，只是某一 时刻的吸光度等于主波长吸光度减去次波长吸光度。第二章生化自动化分析方法概要一、分析方法分类一终点法
6、被测物质在反应过程中完全被转变为产物，即达到反应终点，依照终点吸光度 的大小求出被测物浓度，称为终点法（end essay。实际上被测物并没有完全被转变, 而只是与产物达到一个动态的化学平稳，因此该法称为平稳法更为恰当。从时刻 - 吸光度曲线来看，到达反应终点或平稳点时，吸光度将不再变化。分析仪通常在反 应终点邻近连续选择两个吸光度值，求出其平均值运算结果，并可依照两点的吸光 度差来判定反应是否到达反应终点。终点法参数设置简单，反应时刻一样较长，周 密度较好。终点时刻的确定：依照时刻-吸光度曲线来确定，如Trinder反应测定尿酸，反应曲 线上35mi n时其吸光度已趋向稳固，因而可将5min
7、作为反应终点。依照被测物 反应终点，结合干扰物的反应情形来确定，如在血清白蛋白的溴甲酚绿法测定中， 白蛋白与溴甲酚绿在10s内专门快完成反应，之后a球蛋白和卩球蛋白与溴甲酚绿发生 慢反应，使反应曲线上吸光度在10s后仍连续缓慢上升，连续约达10mi n,因此终 点时刻应采纳1030s，而不应选择10min。1一点终点法 ：在反应到达终点，即在时刻-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择 一个终点吸光度值，这种方法称为一点终点法one point end essay，其反应曲线见 图7-3。其检测结果的运算公式是：待测物浓度CU=待测吸光度AU试剂空白吸 光度ABxK。K为校准系数，详见第五节二操作方
8、法。2两点终点法 ：在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反 应到达终点或平稳时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于运算结果，称为两 点终点法two point end essay，其反应曲线见图7-4。运算公式为CU=待测吸光 度A2待测吸光度A1xK。该法能有效地排除溶血hemolysis、黄疸icterus 和脂浊1 ipo-turbid等样品本身光吸取见图7-5造成的干扰。在单试剂分析加 入试剂的初期、或双试剂分析中第二试剂加入之初，假设指示反应吸光度尚未明显 变化，那么可在现在选择第一个吸光度，在指示反应终点时选择第二个吸光度，从 而设置成两点终点法。但指示反应初期
9、吸光度无明显变化的化学反应较少，如单试 剂方式测定总蛋白、白蛋白、钙、磷、镁等的终点法分析项目，及双试剂方式测定 葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的终点法分析项目，因反应初期吸光度已有明显变 化，因而均难以用上述方式设置两点终点法。但在双试剂分析中，假如将第一吸光 度选择在第二试剂加入前，现在指示反应一样尚未开始，那么能容易设置两点终点 法。在此要注意必须将两次读吸光度时不同比色液体积进行校正。目前全自动分析 仪均具有此自动校正功能，不必手工进行校正。二固定时刻法 指在时刻-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光 度，这两点的吸光度差值用于结果运算，称为固定时刻法fixe
10、d-time essay，反应 曲线见图7-6。其运算公式与两点终点法相同，为CU=(A2-A1)xK。有时也称此法为 两点法。该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。例如：苦味酸法测定肌酐，反应 的最初30s内，血清中快反应干扰物如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等、能与碱性苦 味酸反应；在第二个30s时碱性苦味酸要紧与肌酐反应，且此段时刻一吸光度曲线的 线性较好故也可用连续监测法测定肌酐；在80120s及其以后，碱性苦味可与蛋 白质以及其它慢反应干扰物反应。如此选用反应的第二个30s为测定时刻，既幸免了 快反应物质的干扰，也幸免了慢反应物质的阻碍，使肌酐浓度与吸光度变化呈良好 的线性关系，有利
11、于提高分析的特异性和准确度。三连续监测法连续监测法continuous monitoring essay、又称速率法rate essay，是在测定酶活 性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时刻-吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以 此线性期的单位吸光度变化值AA/min运算结果，见图7-7A和B。所谓线性期确 实是各点吸光度差值相等，如图7-7C所示，图中61及85值偏小，而82 = 83 = 84，故 A1点至A4点属线性段。此线性期对底物来说属零级反应，期间的AA/min即为酶促 反应的初速度，其大小与被测酶活性成正比。连续监测法的优点即是能够确定线性 期并运算AA/min，依照此值再准确地运
12、算酶活性，因而使自动生化分析仪在酶活性 测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度， 一样是某些基于酶法测定的代谢物。酶活性U/L=AA/minx理论或校准K值， 代谢物浓度CU=AA/minx校准K值。关于理论K值和校准K值表达如下：1. 理论K值：多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用，因而 依照酶活性的国际单位定义得出酶活性的运算公式为：酶活性(U/L)=AA/minx ， 将此式中以K来表示，此K值可通过对值即指示物质的毫摩尔消光系数&、反应 液总容量TV、样品容量SV、和比色杯光径d、运算后得出，即为理论K值， 可作为分析参数输入到分析仪中。采纳
13、理论K值的前提应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度操纵精 确以及波长准确等。但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进电机精度、滤光片 带宽等方面的差异，可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差。温度的阻碍有 时也专门大，由于反应盘是半暴露的，因此随着较冷试剂的加入，反应盘中的温度 会逐步降低，尽管开始测定时反应盘温度已升到37C,但在某一项目测定过程的开 始时期，温度可能达不到37C，甚至仅35C左右，且反应过程中仍有可能上下波 动，这关于酶学反应来说阻碍是专门大的。如采纳37C时的理论K值，将会使测定 结果降低，温度的波动还会使得结果的重复性降低。因此，假设试剂在加入反应杯 前经试
14、剂臂内加热装置预温，那么差不多不阻碍反应盘温度。由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长、带宽以及加样系统的准确性等的阻碍，书 本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不同，因而 有必要获得实际的摩尔吸光系数，然后用来运算的K值称为实测K值。 NADHNADPH、摩尔吸光系数的测定：NADHNADPH、没有标准纯制品， 而且配成溶液后稳固性又较差，不能直截了当用NADH或NADPH标准液来校正仪 器，须通过有NAD+(NADP+)参与的反应途径。用已糖激酶(HK)或葡萄糖脱氢酶 (GD)方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系。葡萄糖有标 准纯制品，又有国家批
15、准文号的葡葡糖标准液。因此，依照公式A=sbC，比色杯光 径b和葡萄糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度 A后便可运算出NADHNADPH、的摩尔吸光系数为 A/bC。假设，葡萄糖标准液浓度为 10mmo1/L(0.01mol/L),标准液加入量为3.5yL，酶试剂加入量为335yL，比色杯光 径为0.7cm,在340nm测得吸光度为0.465,那么实测N ADH摩尔吸光系数=6424，即在此台分析仪上340nm波长处测得NADH (NADPH、的摩尔吸光系数为6424，而 理论上NADH (NADPH、的为6220。2、色素原酶促产物在405nm波长摩尔吸光系数的测定：有许多酶底物为人工合
16、 成的色素原底物，其本身无色，经酶作用后开释出有色的反应产物，在405nm波 长具有吸取峰。最常用色素原底物及其产物为 ：ALP测定以磷酸对硝基苯酚 (4-Nitrophenyl phosphate ， 4-NPP) 为底物，经酶作用后开释出黄色的对硝基苯酚 件Nitrophenol, 4-NP), GGT测定以丫-L-谷氨酰对硝基苯胺(丫-L-Glutamyl-p-nitroanilide) 或y-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺(Y-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)为底物，经酶作 用后开释出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroaniline, 4-NA)或对硝基-5-氨基苯甲酸 (2
