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1、豆制品、火锅、麻辣烫等食品中喹诺酮类化合物的测定BJS 2019091 范围本标准规定了豆腐、豆干、火锅底料、麻辣烫底料及火锅和麻辣烫的食材中诺氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟罗沙星、沙拉沙星、双氟沙星、司帕沙星、环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星的高效液相色谱-串联质谱检测法。本标准适用于豆腐、豆干、火锅底料、麻辣烫底料及火锅和麻辣烫的食材中诺氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟罗沙星、沙拉沙星、双氟沙星、司帕沙星、环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星的测定和确证。2 原理采用 0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液提取样品中的喹诺酮类化合物， 经离心和过滤后，上清液经 H
2、LB 固相萃取柱净化后，用高效液相色谱 -串联质谱仪检测和确证，内标法定量。3 试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯，水为GB/T 6682 规定的一级水。3.1乙腈（ CH 3CN）：色谱纯。3.2甲醇（ CH 3OH ）：色谱纯。3.3甲酸（ CHOOH ）：色谱纯。3.4甲醇（ CH 3OH ）。3.5氨水（ NH 4OH ）：浓度25% 28%。3.6乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2Na2O82H2O）。3.7柠檬酸（ C6H8O7H 2O）。3.8磷酸氢二钠（ Na2HPO 412H2 O）。3.9氢氧化钠（ NaOH ）。3.10 盐酸（ HCl ）： 含 HCI 3
3、8% 。3.11 乙酸铵（ CH 3COONH 4）：色谱纯。3.12 磷酸氢二钠溶液 （ 0.2 mol/L ）：称取 71.63 g 磷酸氢二钠 （3.8），用水溶解并定容至1000mL 。3.13柠檬酸溶液（ 0.1 mol/L ）：称取 21.01 g 柠檬酸（ 3.7），用水溶解并定容至 1000 mL 。3.14Mcllvaine 缓冲溶液：将 1000 mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液（ 3.13）与 625 mL 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液（ 3.12）混合，用盐酸或氢氧化钠调节pH 至 4.0 0.1。3.15EDTA-Mcllvaine缓冲溶液（ 0.1 mol/L
4、 ）：称取 60.5g 乙二胺四乙酸二钠 （ 3.6）至 1625mLMcllvaine 缓冲溶液（3.14）中，超声使其溶解。3.165%甲醇水溶液：取 5 mL 甲醇（ 3.4），用水稀释至 100 mL 。3.1725% 氨水甲醇溶液：取 25 mL 氨水（ 3.5），用甲醇（ 3.4）稀释至 100 mL 。3.18标准品：标准品中文名称、英文名称、CAS 登录号、分子式、相对分子质量见附录A表 A.1 ，纯度 99%。3.19 标准储备液配制： 分别精密称取标准品（ 3.18）约 10 mg，置 10 mL 容量瓶中， 加入 0.2 mL甲酸（ 3.3），超声使溶解，用乙腈（ 3.1
5、）定容至刻度，摇匀，配制成浓度为 1.0 mg/mL 的标准储备液，转移至溶剂瓶中于 -18以下避光保存，有效期 6个月。3.20混合标准溶液的配制：准确吸取标准储备液（3.19）1 mL 于 100 mL容量瓶中，用甲醇（3.2）定容至刻度，配制成浓度为0.01 mg/mL 的混合标准溶液（环丙沙星、沙拉沙星浓度约0.015mg/mL ），于 4以下避光保存，有效期3个月。3.21混合标准中间溶液的配制：准确吸取混合标准溶液（3.20）1 mL 至 10 mL 容量瓶中，用甲醇（ 3.2）定容至刻度，配制成浓度为 1.0 g/mL的混合标准中间溶液（环丙沙星、沙拉沙星浓度约 1.5 g/mL
6、），于 4以下避光保存，临用新配。3.22内标标准储备液配制：分别称取氘代同位素标准品（3.18）约 10 mg，至 10mL容量瓶中，加入 0.2 mL 甲酸（ 3.3），超声溶解， 用乙腈（ 3.1）稀释至刻度，配制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液，于 -18以下避光保存，有效期 6个月。3.23混合内标标准中间溶液的配制：准确吸取内标标准储备液（3.22）0.01mL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇（ 3.2）定容至刻度，配制成浓度为 1.0g/mL的混合内标标准中间溶液，于 4以下避光保存，临用新配。3.24固相萃取小柱（ 500 mg，6 mL ）：HLB 柱或相当者。使用前依
7、次以 6 mL 甲醇、 6mL 水活化，保持柱体湿润。4 仪器和设备4.1 液相色谱 -串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。4.2 分析天平：感量0.001g 和 0.00001 g。4.3 涡旋振荡器4.4 超声仪4.5 离心机：转速 8000 r/min4.6 均质器4.7 氮气浓缩仪5 测定步骤5.1 试样制备与保存豆制品、火锅和麻辣烫的食材从待检样品中取出样品约500g ，用组织捣碎机充分捣碎混匀，装入洁净容器中，密封，并标明标记，于-18冷冻存放。火锅底料、麻辣烫底料固体状：从待检样品中取出样品约500g，用组织捣碎机充分捣碎混匀，装入洁净容器中，密封，并标明标记，于4冷藏存放。
8、半固体状：从待检样品中取出样品约500g ，放入研钵中，迅速研磨均匀，装入洁净容器中，密封，并标明标记于4冷藏存放。液体状：从待检样品中取出样品约500g，搅拌均匀后装入洁净容器中，密封，并标明标记，于4冷藏存放。5.2 样品溶液制备提取：称取5.0 g 均匀样品（精确至0.001g），置 50 mL 离心管中，精密加入混合内标标准中间溶液（3.23） 0.1mL ，加入 20 mL 0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine缓冲溶液（ 3.15），涡旋混匀 1min，超声提取15 min ， 8000 r/min 离心 5 min，上清液转移至50 mL 容量瓶中 ， 残渣用 EDTA
9、-Mcllvaine缓冲溶液（ 3.15）同法重复提取两次，每次10 mL，合并上清液至同一容量瓶中，用EDTA-Mcllvaine缓冲溶液（ 3.15）定容至刻度，混匀。用滤纸过滤（必要时 10000 r/min 离心 5 min 后过滤），续滤液待净化。净化：精密吸取上述待净化液25.0 mL ，以约1 mL/min的流速全部通过固相小柱（3.24 ），用 3 mL 5% 甲醇水溶液（3.16）淋洗，抽干，先后以6 mL 甲醇、 3 mL脱，合并甲醇及氨水甲醇洗脱液，45 氮吹至近干，准确加入2.0 mL液溶解残渣，过0.22 m滤膜，续滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。氨水甲醇（ 3.17
10、）洗流动相初始比例复溶5.3 基质标准工作溶液的制备称取 5.0 g 空白试样（精确至 0.001g ），置 50 mL 离心管中，除不加入混合内标标准中间溶液外，其余同 5.2 操作处理后得到空白基质，共制备 6 份。分别精密吸取混合标准中间溶液（3.21） 0 mL 、0.010 mL 、0.020 mL 、 0.050 mL 、0.100mL 、 0.200 mL 及混合内标标准中间溶液（3.23） 0.025 mL 于试管中，氮吹至近干，精密加入 1.0 mL 空白基质复溶，过0.22 m滤膜，制成浓度为0 ng/mL 、10 ng/mL 、 20 ng/mL 、 50ng/mL 、1
11、00 ng/mL 、 200 ng/mL 的基质标准工作溶液（环丙沙星、沙拉沙星浓度为15 ng/mL 、 30 ng/mL 、 75 ng/mL 、 150 ng/mL 、 300 ng/mL ，同位素内标浓度约0 ng/mL 、25ng/mL ）。5.4 测定液相色谱参考条件1） 色谱柱： C18 色谱柱， 2.1 mm50 mm1.7 m，或性能相当者。2） 柱温： 40。3） 流速： 0.25 mL/min 。4） 进样量： 2 L。5） 流动相： A-5 mmol/L 乙酸铵水溶液（含0.1% 甲酸）， B- 乙腈。梯度洗脱条件见表 1。表 1 梯度洗脱条件时间（ min ）A(%)
12、B(%)09010390108703010703010.55951359513.190101590105.4.2 质谱参考条件1） 电离方式：电喷雾电离（ESI ）；2） 扫描方式：正离子扫描；3） 检测方式：多反应监测MRM ；4） 离子源参数参考条件：离子源接口电压， 4000 V ；离子源接口温度， 350 ；脱溶剂温度， 250 ；离子源加热温度， 400 ；雾化气流速， 2.9 L/min ；干燥气流速， 10.0 L/min ；加热气流速， 10.0 L/min 。5）定性离子对、定量离子对参见表2。表 2喹诺酮类药物主要质谱参数序号组分母离子子离子Q1 预四极杆电压碰撞电压Q3
13、预四极杆电压（ m/z）（ m/z）（ V）(V)（ eV）1诺氟沙星320.2*302.0-16-21-21231.1-15-39-252氧氟沙星362.2*318.2-30-18-24261.1-30-28-193洛美沙星352.0*265.0-25-23-29308.0-25-17-224培氟沙星334.0290.1-25-18-20*316.2-25-21-225氟罗沙星370.0*326.0-30-20-23269.0-29-28-26342.0-15-19-256沙拉沙星386.2299.1-29-30-20*368.1-14-22-267双氟沙星400.0*356.0-17-20-25299.0-17-28
