《高分辨率熔解曲线技术常用的仪器和荧光染料》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高分辨率熔解曲线技术常用的仪器和荧光染料（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、高分辨率熔解曲线技术常用的仪器和荧光染料郭心灵;尤崇革【摘要】高分辨率熔解曲线技术(HRM)是近年来发展迅速的一项用于基因突变扫 描与检测的新技术.由于具备快速、简便、价廉、高通量和闭管均相检测等优点,HRM已被广泛地应用于突变基因的扫描、基因分型、遗传配型以及法医学鉴定 等领域,并受到越来越多的关注且发展迅速.本文就该技术常规应用时的相关仪器与 荧光染料的发展及应用进行分析总结.期刊名称】 分子诊断与治疗杂志年(卷),期】 2012(004)001【总页数】4页(P50-53)【关键词】高分辨率熔解曲线技术;聚合酶链反应;荧光染料;PCR仪【作 者】 郭心灵;尤崇革【作者单位】 兰州大学第二
2、医院中心实验室,甘肃,兰州730030;兰州大学第二医院中心实验室,甘肃,兰州730030【正文语种】 中 文高分辨率熔解曲线技术(high resolution melting，HRM )是美国Utah大学Wittwer实验室在2003年首次提出的基于新型饱和荧光染料LC Green的发明而进行基因突变检测的新技术1。其基本原理就是利用与荧光染料结合的双链DNA 在温度升高的过程中会发生减色效应的物理性质，通过检测双链DNA在熔解过程 中释放的染料荧光信号所形成的特征熔解曲线，进行PCR产物中核苷酸差异的鉴 别。该技术的应用不仅需要饱和荧光染料，而且更需要能进行高分辨检测的定量PCR仪。近年
3、来用于HRM技术的仪器和染料都在不断更新，朝着操作简便化、 试剂专业化的方向发展，在常规检测、疾病诊断、实验室研究、前沿问题研究等方 面发挥着重要作用2,3。目前HRM技术可用于基因突变扫描、遗传配型、细菌分 型和多重基因分型等领域4,5。本文就HRM技术的常规开展所需要的相关仪器与 荧光染料进行综述。1 HRM仪器常规定量PCR仪由于温控不够灵敏、分辨率不够高及其熔解曲线无法区分熔解温 度上差异很小的序列（如单核苷酸多态性、单碱基插入/缺失等），所以不能用于HRM分析。HRM分析仪器必须具备温度分辨率高、激发光源强度高、特异性好、 管间温度均一性好、数据采集快等性能。因仪器产生熔解曲线的准确
4、性决定了突变 检测和基因分型的准确性，故在进行HRM检测时选用合适的仪器十分重要。目前 有文献报道可用于HRM检测的仪器主要有以下几种：1.1 HR-1HR-1是美国Idaho公司生产的第一种专门用于HRM的检测仪，只能用于高分辨 熔解曲线分析，而不能进行PCR扩增。该仪器温度控制精度高，与Roche公司 Lightcycler系列毛细管PCR扩增仪匹配使用。HR-1为单通道，一次只检测一个 样本，分析时不消耗被测PCR产物样品，但分析结束后PCR产物不易取出，难以 用于下游分析，如测序等。常用的染料是LC Green。检测时直接将染料加入反应 体系中，扩增好的PCR产物不需要任何处理即可直接
5、用HR-1进行HRM分析， 进行基因突变筛查和SNP的分析分型工作6。1.2 LightScanner（LS）LS是Idaho公司研发的高通量的96孑L板式HRM检测仪，专门用于快速基因突 变扫描和基因分型，与HR-1 样也不能进行PCR扩增。该仪器检测时主要在96 孔板上进行，敏感性和特异性好，整个微孔板的检测同时进行，荧光采集迅速，温 度控制和数据获取优势明显。LC Green染料可在PCR扩增前或后加入，PCR扩 增结束后将产物微孔板转放入LS中进行高分辨熔解曲线的分析。所需时间短、检 测标本量大，适用于疾病筛查及测序前的大规模突变筛查和基因分型7，可以节 省时间及人力物力。由于不是独立
6、的 PCR 管，实验操作不慎容易发生样本间污染 LS32是Idaho公司新近推出的Lightcycler PCR仪的功能增强版，在实时荧光定 量PCR扩增的基础上整合HRM分析功能。在扩增结束后，无需将PCR产物取出 仪器，即可直接做HRM分析以进行突变检测、基因分型和观察探针峰等，配合温 度内标几乎可以检测任何类型的碱基突变8。Lightcycler系列仪器是目前用于临 床的升降温速度最快的qPCR仪。它采用空气循环调节温度,20-30分钟即能完 成PCR扩增，不同波长荧光通道同时检测，可以实时监测PCR反应，反应后由电 脑自动收集、分析数据并给出分析后的结果。反应管是毛细玻璃管，成本较高，
7、反 应体系一般为1025pL,反应产物一般很难取出做后续分析。由于所用的毛细玻 璃管壁薄且是密封的，这样的反应体系的温度调节比较灵敏，且可避免产物在扩增 分析过程中受到污染，因此LS32的灵敏度、准确性及重复性较好。所有样本在同 一个空间内反应，并通过同一光路单独检测，因此管与管间的温度控制及荧光检测 的均一性好，从而使系统误差降到最低。该机采用LED冷光源，开机不需预热、 定期维护和调试。1.3 Lightcycler480（LC480）Lightcycler480是Roche公司生产的具有HRM分析功能的板式全自动荧光定量 PCR仪，有96孔和384孔两种检测模块。其光学检测系统比较好，可
8、以做多重 PCR检测分析及多种探针研究模式分析，主要用于突变检测、产物分型、SNP研 究和微生物的诊断9,10。临床上常用于病毒DNA、RNA的检测，以协助疾病诊 断及预后治疗。1.4 Rotor-gene 6000 或 Rotor-gene Q(RG)Rotor-gene 6000是澳大利亚Corbett Life Science公司生产的全球第一款成功 将qPCR扩增与HRM结合在一起实现闭管操作的仪器，有36孔和72孔两种模 块，后来被德国Qiagen公司收购并改名为Rotor-gene Q，且增加了一个100 孔的模块。该仪器采用离心式空气循环调节温度，反应管是EP管(36孔模式) 和
9、特制4联管(72孔模式)，适用于各种PCR，而且PCR产物容易取出，方便 进行后续分析，如电泳、测序等。其管与管之间均一性好，温度分辨率很高而且变 温灵敏；可以从单通道到六通道随意调整，也可以用UV或是红外光源；无需清洁 样品孔及更换光源，简单便捷。主要用途有高分辨熔解曲线分析(HRM)、定量 扩增、定性终点检测、常规熔解/退火、基于探针的基因分型、浓度测定和细菌检 测等11。Gorringe等12使用该仪器成功地研究了卵巢癌CHD5基因的突变和 甲基化，获得了可靠的数据。2 HRM荧光染料自从Wittwer提出HRM概念后，大量的研究发现，用于HRM的荧光染料并非 普通染料，而是特定的饱和荧
10、光染料。目前常见的HRM荧光染料有LC Green、 Syto9 和 Eva Green。2.1 LC Green(LCG)LCG是美国Idaho公司专门设计的最早应用于HRM分析的饱和荧光染料1，用 于检测DNA序列变异体，其分析杂合位点的灵敏度很高。LCG在PCR前加入并 不抑制PCR过程，还可以用于多重PCR分析；DNA高温变性时，解链部分的 LCG 染料不会发生分子迁移，故特异性好；也可用于高 GC 含量的 PCR 产物扩增 加入LCG可使熔解温度增加13工，实验时需调整扩增条件，其最适MgCl2浓 度在2.03.0 mmol/L之间。LC Green I(LCG I)是专门设计用于H
11、R-1进行HRM分析的荧光染料13。2.2 LC Green Plus（LCG+）LC Green+是Idaho公司专门设计用于LS进行HRM分析的饱和荧光染料。其荧 光强度高、稳定性好，目前适用于多种HRM仪，如：HR-1、LS系列、LC480、 RG等，也可进行SNPs分析、基因分型等。2.3 ResoLight（RL）RL是Roche公司专门设计用于LC480进行HRM分析的饱和荧光染料，这个染 料有特殊的结合特性，即使在高浓度时也能使用而不抑制PCR。对目标序列染色 的均一性好，可以得到清晰的熔解曲线，能清楚辨认出纯合子和杂合子的差异及野 生纯合和突变纯合的差异。2.4 Syto9（S
12、9）S9是Syto系列花青素核酸荧光染料中的一种。它最初用于细菌染色，能渗透细 胞，在结合核酸后可激发出强大的荧光信号，使DNA和RNA染色，后来用于 qPCR。HRM技术出现后，Tedde等14利用该染料在RG 6000上通过HRM分 析进行基因分型，结果发现携带AG/AA IL-10基因型及AC/AT单元型的女性在 年轻时更容易患溃疡性结肠炎，从而奠定了 S9作为HRM染料的基础。2.5 SYBR Green 1（SYBR）SYBR Green 1为非饱和DNA结合荧光染料，多用于各种电泳分析。大多数研究 者认为，SYBR Green 1因存在染料再分布而使其在HRM过程中造成误差大、特
13、异性差的结果，然而有研究发现，SYBR Green 1在RG 6000上用于HRM分析 的效果很好，并不需要特殊处理15。Pornprasert等16在地中海贫血相关基因 的研究中应用SYBR Green 1染料做多重PCR扩增并进行HRM分析，曲线清楚 且分型准确。2.6 Eva Green（EG）EG是Biotium公司生产的一种用于实时定量PCR的DNA结合染料，具有极高的 灵敏度，对PCR抑制性极小，可常温保存。除用于qPCR外，也适合HRM分析 17。EG染料在光谱特性上与FAM和SYBR Green 1相似，因此它可以用于绝 大多数商业化实时PCR仪。而且EG染料非常稳定且无致突变
14、性和细胞毒性，所 以比SYBR Green系列更有优势，但价格相对较高，却仍低于LCG和S9。3 HRM仪器和染料的应用情况从HRM技术诞生以来，其在科研和临床中的应用日趋广泛。Wittwer实验室统计 了截至2010年底国际上所有报道利用HRM技术进行基因分型的文献资料，结果 如下：HRM技术主要用于人类遗传性疾病的相关基因分型18、家族遗传性疾病 相关基因位点筛查19,20,21、肿瘤筛查2226和人类感染性疾病相关病原体的 检测25以及甲基化分析26,27等方面，相关仪器和荧光染料的应用情况见表1。表1已完成的疾病相关基因研究中HRM仪器和染料的应用情况(单位：篇数) Table 1 T
15、he application of HRM instruments and dyes in the completed study of disease genes (units:article number)HRM 仪器荧光染料 LCG I LCG+ RL S9 SGER1 EG 合计 HR-1 41 51 0 2 0 1 95 LS 0 34 0 1 0 0 35 LS32 04 0 0 0 0 4 LC480 0 11 42 0 0 0 53 RG 1 5 2 43 9 8 68 合计 42 105 44 46 9 9 255由上表可知，其中应用最广的仪器是HR-1,其次是RG、LC48
16、0和LS , LS32使 用最少；最常用的饱和染料是LCG+，其次是LCG I、RL和S9 , EG和SGER1用 得较少；LCG I染料主要是与HR-1配合使用；LCG+可配合用于多种仪器；RL染 料主要是配合LC480使用；S9、EG和SGER1主要用于RG ； RG可配合使用多 种染料，而其余仪器均是专配染料。4 小结综上所述，对HRM仪器与染料的发展及应用的认识有利于研究者更好地运用HRM技术，它作为一种高效廉价的基因突变扫描和检测方法将被广泛地应用于分 子生物研究和疾病检测领域。由于HRM技术在基因突变扫描方面的卓越性能倍受 关注，目前已用于体细胞突变检测；而其基因分型的局限性也在其它辅助技术如无 标记探针技术等的协助下得到突破，从而使HRM技术成为时代的宠儿，显示出广 阔的应用前景。参
