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1、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)致病力分化的研究学 科 门 类：理学一级学科名称：生物学二级学科名称：微生物学研 究 方 向：应用微生物研 究 生：程本亮指 导 教 师：刘波 研究员完 成 时 间：二O一O年四月M.S. Thesis of Fujian Agriculure and Forestry UniversityThe study on differentiation of pathogenicity of Ralstonia solanacearum Discipline: ScienceFirst Rank Discipline: BiologySec
2、ond Rank Discipline: MicrobiologyResearch Field: Applied microbiologySupervisor: Prof. Dr. Liu BoSubmitted Time: April, 2010独创性声明本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位（毕业）论文作者亲笔
3、签名：日期：论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅; 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密，在年后解密可适用本授权书。不保密，本论文属于不保密。学位（毕业）论文作者亲笔签名：日期：指导教师亲笔签名：日期：目 录中文摘要IAbstractII第一章 绪论11 青枯病11.1 青枯病的发生与危害11.2 青枯病的防治12 青枯雷尔氏菌及其致病机理的研究进展22.1 青枯雷尔氏菌22.2 青枯雷尔氏菌的致病机理23 青枯雷尔氏菌种下分化的研究进展34 青枯雷尔氏菌致病
4、力分化的分子机理44.1 EPS I合成相关基因44.2 胞外蛋白及II型分泌系统和III型分泌系统的相关基因44.3 网络状调节系统相关基因55 研究目的及创新性6第二章 不同作物中的青枯雷尔氏菌致病力分化71前言72 材料与方法72.1材料72.2方法72.3 统计83 结果与分析83.1 青枯雷尔氏菌的鉴定83.2 青枯雷尔氏菌致病力的测定93.3 番茄植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化113.4 花生植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化123.5 生姜植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化124 讨论13第三章 生防菌作用下青枯雷尔氏菌致病力分化的研究151前言152 材料与方法152.1材
5、料152.2 方法162.3 统计163 结果与分析163.1 生防菌作用下青枯雷尔氏菌致病力分化163.2 生防菌持续作用下青枯雷尔氏菌Rs91的致病力分化183.3 青枯雷尔氏菌Rs91和Rs1100的继代培养过程的致病力分化194 讨论20第四章 青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理221前言222材料和方法222.1材料222.2 方法222.3 统计233 结果与分析233.1 青枯雷尔氏菌的转化233.2 青枯雷尔氏菌Tn5突变株Kmr基因的验证243.3 青枯雷尔氏菌Tn5突变株的遗传稳定性253.4 青枯雷尔氏菌突变株致病力测定263.5 青枯雷尔氏菌无致病力突变株插入位点284
6、讨论28第五章 青枯雷尔氏菌无致病力突变株与原始菌株的生物学异质性研究301前言302材料和方法302.1材料302.2 方法302.3 统计323 结果与分析323.1 初始pH值对无致病力突变株生长的影响323.2培养温度对无致病力突变株生长的影响333.3无致病力突变株生长曲线异质性333.4无致病力突变株胞外多糖含量异质性343.5无致病力突变株TTC液体培养基分光光度计吸收峰分析354 讨论36第六章 结论与展望38参考文献40附录45个人简历48致 谢49i中文摘要通过对青枯病不同发病时期不同部位的番茄、花生和生姜植株的青枯雷尔氏菌进行分离，从番茄青枯病发病初期的病株根部和青枯病发
7、病后期的病株茎中部分离到的青枯菌中除了强致病力的菌株外，还分离到少量无致病力的菌株，从生姜病株的茎上分离到的青枯菌全都是无致病力的菌株。通过生防菌ANTI-8098ABC-0711和青枯雷尔氏菌1：1共培养试验，表明生防菌ANTI-8098ABC-0711对供试青枯雷尔氏菌均有抑制作用，但是对不同菌株的抑制率有所差异，生防菌对Rs466菌株的抑制率仅为4.6，对Rs91和Rs1447的抵制率较高，分别达到78.3和79.9，对其他菌株的抑制率介于43.559.6之间。对强致病力青枯雷尔氏菌Rs91和Rs1100连续5代的继代培养后发现Rs91未出现致病力分化，而Rs1100在第五代时出现致病力
8、分化。生防菌ANTI-8098ABC-0711对Rs91连续处理3代后，未出现致病力分化，对Rs1100第一次处理后即出现无致病力菌株的分化。通过Tn5转座子随机插入青枯雷尔氏菌(Rs91)获得1004株转座子随机插入突变株，其中有13株突变株具有无致病力青枯雷尔氏菌的形态特征，通过对其中5株突变株在TTC平板上的形态特征和番茄盆栽苗生物测定结果确定为无致病力菌株。经反向PCR测序和序列比对，分析鉴定出这5 株无致病力青枯雷尔氏菌突变株中有4株的插入位点分别位于phcA基因，有1株突变株的插入位点位于phcS基因上，并比较了这5株突变株与原始菌株的生理生化特性，这5株突变株的生长速率和相对胞外
9、多糖含量显著低于Rs91，这5株突变株的TTC液体培养基在紫外-可见分光光度计上于400-450nm波长上进行扫描，通过聚类分析，这5株突变株与Rs91分别聚为三类，插入位点位于phcA基因上的菌株聚为一类，插入位点phcS基因上的突变株为一类，原始菌株为另一类。关键字：青枯雷尔氏菌，致病力，分化，Tn5转座子，突变Abstract Ralstonia solanacearum were isolated from different parts of tomato, peanut and ginger in the different stages of bacterial wilt dis
10、ease. The isolated strains included not only virulent strains but also avirulent strains in the root of tomoto in the early stage of bacterial wilt disease, the stem of tomoto in the late stage of bacterial wilt disease. The strains isolated from the stem of ginger both were the avirulent strain. Th
11、e inhibitons of the biocontrol bacterium strain ANTI-8098ABC-0711 (Bacillus cereus) against ten Ralstonia solanacearum virulent strains were investigated.But the inhibitions were diverse in different Ralstonia solanacearum virulent strains. The inhibitons of ANTI-8098ABC-0711 against Rs466 was only
12、4.6%,and significantly different from Rs91 and Rs1447,which respectively was 78.3 and 79.9, and the others were between 43.5%-59.6%.After subculturing 5 generations , differentiation of pathogenicity didnt appeare in Rs91, but appeared in Rs1100 when it was subcultured to the fifth generation. ANTI-
13、8098ABC-0711 and Rs91 were co-clutured for three generations, and its differentiation of pathogenicity still didnt appear. But Rs1100s differentiation of pathogenicity appeared after co-clutured with ANTI-8098ABC-0711 in the first generation. Mutants of Ralstonia solanacearum(strain Rs91) were const
14、ructed by using Tn5 transposon mutagenesis. And there were 1004 mutants being obtained. There are five avirulent mutants were identified by TTC medium and bioassay of potted tomato.And their insertion site flanking sequences were amplified by inverse PCR and sequenced. There were 4 avirulent mutants whose insertion sites were located in phcA gene. And there was 1 avirulent mutant whose insertion sites were located in phcS gene.The growth curve and the relative content of EPSI of this 5 mutants are significantly lower than strain Rs91.This 5 avirulent mut
