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1、实验教学教案首页本次实验项目：肝脏谷丙转氨酶活力测定本次实验课时：验证性4学时教学要求：1. 掌握实验原理，了解转氨酶的性质及临床意义2. 掌握谷丙转氨酶活力的测定方法重点：实验原理、转氨酶的转氨基作用。教学手段及教具：课堂讲授，学生实验操作。讲授内容及时间分配:课堂讲授1 .相关知识0.1学时2. 实验目的0.1学时3. 实验原理 0.3学时4. 实验操作0.2学时实验教学肝脏谷丙转氨酶活力测定实验的操作技术3学时参考资料生物化学实验肝脏谷丙转氨酶活力测定（验证性）相关知识1 .酶的提纯基本操作程序及基本原则2. 酶的活力单位（IU）的定义及酶活力的测定（酶的定量测定）3. 测定酶活力一般经
2、如下几个步骤 选择适宜的一定浓度的底物。 确定酶促反应的条件。优化条件 将一定量的酶液和底物溶液混合，确定反应时间（因要测定酶促反应初速度）。 反应到一定时间后取出反应液终止反应。 测定产物的生成量。 计算酶活力、酶的比活力。4. 酶的比活力一一表示酶纯度的指标每单位酶蛋白所含的活力单位数。对固体酶：比活力=活力单位/mg酶蛋白对液体酶：比活力=活力单位/ml酶液比活力越大，酶的活力越大，含酶量或有活性的酶量越多。5. 总活力、纯化倍数和回收率6. 酶活力测定方法一不同酶选用不同的方法7. 氨基酸转氨基作用、联合脱氨基作用COOHRICHNH2COOH 仃一氨基酸转氨酶虬互=0 CCCCOOH
3、口一酮戊二酸nh3+nadh+h ，或 nadph+h+L-谷氨酸脱氢酶8 .谷丙转氨酶及临床意义：查肝功为什么要抽血化验转氨酶指数呢？谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶*ST, GOT）是人体内糖和蛋白质互相转变所需的酶+ 人再生体内分布广泛。ALT的分布以肝中最高，主要存在于肝细胞浆中，AST存在于肝细胞浆 和线粒体内。其次是肾）。心、骨骼肌、脾等。扁的分布则以心肌最高，其次为肝、骨骼肌、 肾脏等。 谷丙转氨酶为细胞噂，血清中活性很低，各组织器官中以心和肝的活性最高。当某种 原因使细胞膜通过性f,转氨酶可大量释放入血液，血清中转氨酶活性ffo 抽血化验若转氨酶比正常水平偏高则有可能肝组织受损
4、破裂，肝细胞的转氨酶进入血液。（结合乙肝抗原等指标进一步确定是什么原因引起的） 常作为疾病诊断、观察疗效和预后的指标：急性肝炎：S-GPT ff、S-GOT f心肌梗塞：S-GOTff一、实验目的1. 了解转氨酶的性质及临床意义2. 掌握谷丙转氨酶活力的测定方法二、实验原理联合脱氨基作用是大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与谷氨酸氧化脱氨基 作用偶联而完成。丙氨酸及a 一酮戊二酸为谷丙转氨酶的作用底物，利用内源性（肝细胞已 有的）磷酸毗哆醛作辅酶，在一定条件下及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定酶活 力。丙酮酸能与2,4-二硝基苯肼结合，生成丙酸一2,4二硝基苯腙，后者在碱性溶液中
5、呈现 棕色，其吸收光谱的峰为439530nm，可用于测定丙酮酸的含量。a 酮戊二酸也能与2,4- 二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光谱为与丙酸-2,4二硝基苯腙 的吸光度有差别，在520nm波长比色时，丙酮酸一2,4二硝基苯腙吸光度高出3倍。在520nm 处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸与a 酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系，故可 以测定谷丙转氨酶的活力。谷丙转氨酶（简称GET、ALT,在血清中的正常值是5（0）40U/L以内）催化反应：丙氨酸 + a -酮戊二酸 丙酮酸+ 谷氨酸COOHCH3R丙氨酸ch3 GTPCOOH ”一氨基酸 丙酮酸 虱酶%;一CCCCOO
6、H口一酮戊二酸nh3+nadh+h* 或 nadph+h+L-谷氨酸脱氢酶三、 实验器材、试剂、材料COOH / （一） 材也口新鲜猪肝脏、I / H2O+NAD+或NADP+（二）器材722型分光光度计、剪刀、吸管、玻璃均浆器（三）试剂OHCH21 .标准丙酮酸溶液（1ml相当于500ug）；准确称取纯化丙酮酸钠62.5mg，溶于100ml0.5mol/LH2S04中，临用前配制。HN%2 .谷丙转氨酶底物；称取L-丙氨酸0.90g及a -酮戊二酸29.2mg，先溶于pH7.4 0.1mol/L磷酸缓冲液中，然后用1 mol/LNaOH调至pH7.4，再用pH7.4 0.1mol/L磷 酸缓
7、冲液稀释至100ml，贮藏于冰箱内驰保存一周。3. 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.4）；称取 13.97g K2HPO4 和 2.69g KH2PO4 溶于 1000ml 蒸 馏水中。4. 0.02%2,4二硝基苯肼；称取2,4-二硝基苯肼20mg溶于少量1 mol/L HCl中，加热 溶解后，用1 mol/L HCl稀释到100ml。5. 0.4mol/L NaOH溶液 6 .生理盐水四、实验操作步聚准备工作：打开水浴锅恒温37度；722E型分光光度计通电预热。1. 肝匀浆制备（每四组做1份，共用）将鸡肝脏用生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取肝脏0.25g，剪成小块，置于玻璃匀浆管内（或小
8、研砵中），加入2.25ml预冷的pH7.40.1%mol/L磷酸缓冲液，制成10%肝 匀浆。吸取肝匀浆0.1ml于另一试管中，加入预冷的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）4.9ml 摇匀，为稀释肝匀浆（稀释50倍）。2.谷丙转氨酶活力测定（每组做1份） 取试管4支按下表加液测定管标准管对照管空白管谷丙转氨酶底物/ml0.50.5-混匀后，37C水浴准确保温5分钟稀释肝匀浆/ml0.1-0.1-标准丙酮酸-0.1-水-0.1混匀后，37C水浴准确保温30分钟2,4 -二硝基苯肼/ml0.50.50.50.5谷丙转氨酶底物/ml-0.50.5混匀后，37C水浴准确保温30分钟0.4mol/L
9、 NaOH5.05.05.05.0i争止10分钟A520谷丙转氨酶活力单位：规定酶在37与底物作用30min后，能产生2.5ug的丙酮酸为一个谷 丙转氨酶活力单位。五、实验结果与讨论1. 谷丙转氨酶活力计算基础：规定酶在37C与底物作用30min后，能产生2.5ug的丙酮酸 者为一个谷丙转氨酶活力单位。2. 测定管一对照管的吸光度值，与标准管相比算出其相当于丙酮酸含量。3. 根据公式计算：（注意稀释倍数，理解公式） 每毫升稀释肝匀浆谷丙转氨酶活力单位： 每克肝脏谷丙氨酶的活力单位。4 .计算出比活力比活力=活力单位/ml酶液六、注意事项1 .分析（列表）各管与计算实验结果（OD值）相关的物质成分。管别各管与实验结果有关的呈色反应的物质来源空白管2,4 -二硝基苯肼+ ?标准管2,4 -二硝基苯肼+ ?2,4 -二硝基苯肼+ ?对照管2,4 -二硝基苯肼+ ?2,4 -二硝基苯肼+ ?2,4 -二硝基苯肼+ ?测定管2,4 -二硝基苯肼+ ?2,4 -二硝基苯肼+ ?2,4 -二硝基苯肼+ ?2,4 -二硝基苯肼+ ?
