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1、大肠菌群的检测方法二1. 原理一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人、畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价产品的卫生质量，推断产品中有否有污染肠道致病菌的可能。2. 仪器及设备2.1恒温培养箱2.2玻璃平板或一次性无菌平板2.3多头滤器及配套设施2.4 滤膜（0.45 um）2.5镊子2.6高压灭菌锅2.7牛皮纸，棉绳，橡皮筋2.8冰箱（28C）2.9塑料瓶2.10酒精灯2.11三角瓶，橡皮塞2.12超净工作台2.13取样袋2.14 75% 酒精2.15无菌蒸馏水3. 培养基和试剂3.1 培养基： 大肠菌群显色培养基 Chromogenic Colif
2、orm Agar medium（ CCA medium）制备：根据供应商提供的说明书，搅拌加热煮沸至完全溶解，不要高压蒸汽灭菌，不要过度加热。待培养基冷却至472C，分装至平板，厚度为4mm。倒置冰箱保存。3.2氧化酶试纸3.3酵母浸膏培养基（无葡萄糖PCA）或胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）4. 操作步骤：4.1过滤及培养4.1.1灼烧过滤头除菌，使用无菌镊子将滤膜贴放于已冷却的过滤头上，安装滤杯。在CCA平板上 记录相关信息。大肠菌群的检测方法二4.1.2过滤前充分摇晃，混匀待测样品，将待测样品倒入滤杯中。4.1.3使用无菌镊子小心转移滤膜至CCA培养基，无菌操作。4.1.4将平板倒置于362C
3、培养21-24小时4.2结果判读4.2.1分别计数不同类型的菌落，根据下表对菌落进行验证：CCA琼脂上的菌落类型氧化酶试验紫罗兰色菌落NA粉红色菌落V其他类型菌落NA注：NA表示不适用（1）所有的紫罗兰色菌落均确认为大肠埃希氏菌，不需要进行氧化酶试验（2）部分CCA平板上可能出现蓝绿色菌落，这部分菌落不应该记录为大肠菌群或大肠杆菌。（3）对粉红色的菌落，证实试验是必须的。4.3验证试验4.3.1氧化酶试验挑取至少10个菌落进行该试验（如果总的粉红色菌落少于10个，则应挑取全部菌落进行试 验），可直接挑取CCA平板上的菌落进行氧化酶测试，但务必注意，粉红色菌落本身带有颜 色，浅红色或无色均被认为
4、是阴性结果。紫红色才被认为是阳性结果。禁止使用铁质或镍铬 丝接种环。4.4分离纯化试验4.4.1 TSA 划线如果由于菌落太小，或者菌落之间太近存在融合，则使用接种环小心挑取部分菌落，划线 接种在TSA培养基上。倒置于362C培养222H，然后再挑取单菌落进行氧化酶试验。5. 结果报告大肠菌群的结果=（紫罗兰色的菌落数+确认为大肠菌群的粉色菌落数）/过滤体积单位报告为CFU/V mL6. 试验要求参见达能脉动盖检测计划表BK-QFHSE-QI-QA-CL001附件17大肠菌群的检测方法二附：CCA平板上的菌落形态A：可能出现的大肠菌群菌落形态B：可能出现的其它非大肠菌群菌落形态白色慎落绿色或蓝绿色菌落
