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1、细胞色素C的制备及其测定及思考题答案一、实验原理1、通过细胞色素C的制备，了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤;2、掌握制备细胞色素C的操作技术及其含量的测定方法。二、实验原理：细胞色素C的特点与实验原理分子量1200013000,蛋白质部分含104个氨基酸残基可溶性易溶于水和酸性溶液，可在酸性水中提取形态氧化型（深红色）、还原型（桃红色），氧化型较稳定稳定性对热、酸、碱都较稳定，三氯乙酸和乙酸可使其失活光吸收氧化型：408nm、530nm；还原型：415nm、520nm、550nm,光吸收法测其含量来源心肌组织、酵母三、实验器材、材料及试剂:1、器材：捣碎机、离心机、磁力搅拌器、可见分光光度计
2、、玻璃层析柱（2.5cmX30cm）、透析袋、纱布、 广泛PH试纸、精密PH试纸、烧杯（2000、1000、500mL）、量筒、移液管、玻璃漏斗、玻璃棒等；2、 材料：（1）新鲜猪心、（2）人造沸石（6080目）、（3） 0.25mol/L NaOH和1mol/L NaCl混合液、 （4） 0.2%NaCl, 12%BaCl2, 20%TCA, 2mol/L H2SO4、（5） 0.06mol/L 磷酸氢二钠、0.4mol/L 氯化钠、（6）1%BaCl2三、实验步骤:1、细胞色素C的制备:操作简要详细操作原理目的（1）提取取50g心肌肉糜放入500mL烧杯中，加100mL水，磁力搅拌器搅拌，
3、 2mol/L H2SO4调PH到4.0（溶液暗紫色）,室温搅拌2小时。用1mol/L NH4OH调PH至6.0,停止搅拌。用四层纱布挤压过滤，取滤液，滤渣 称重，于冰箱保存在酸性条件下溶解细胞色素C（2）中和用1mol/L NH4OH调PH到7.2,静置10min,过滤，滤液通过人造沸 石柱进行吸附析出等电点在7.2的 溶解度小的蛋白（3）吸附与洗 脱用25%硫酸铵洗脱将细胞色素C与杂蛋 白分开人造沸石预处理取60g，放入500mL烧杯中，加水搅拌，用倾泻法除去12秒内不沉 的过细颗粒，重复6次使沸石颗粒均匀装柱玻璃柱（2.5X30cm），柱下端连接一乳胶管，用夹子夹住，柱中加入 蒸馏水至2
4、/3体积，保持柱垂直，然后将已处理好的人造沸石带水 装填人柱，注意一次装完使沸石能够均匀地装 到柱中，避免柱内出现 气泡上样打开夹子，流出液的速度为1.0ml/分钟放水（柱内沸石面上应保留 一薄层水），将提取液装入下口瓶，通过人造沸石柱进行吸附。柱内 人造沸石由白色变为红色，流出液应为黄色或微红色使沸石能够吸附细胞 色素C洗脱吸附完毕，往柱中缓慢加入蒸馏水，再100m1 0.2%NaCl，再用蒸馏 水洗至水清，流速控制在3mL/min，用25%硫酸铵溶液洗脱，流速大 约2ml/分钟，收集含有细胞色素C的红色洗脱液，当洗脱液红色开 始消失时，即洗脱完毕先把柱中的杂质洗脱， 去除杂志，然后弱酸性
5、环境下把细胞色素C 洗脱（4）盐析按45%硫酸铵浓度计算洗脱液中需加入的硫酸铵的量，称固体硫酸 铵，研成粉，小量多次加入，边加边搅拌，静置30分钟，3000r/min 离心10min，收集上清，量体积进一步提纯细胞色素C（5）三氯醋酸 沉淀边加20%二氯醋酸边搅拌，细胞色素C立即沉淀出来（可逆变性）， 立即于3000转/分钟离心15分钟，收集沉淀。加入少许蒸馏水，用 玻棒搅拌，使沉淀溶解在可逆的情况下沉淀 细胞色素C，进一步对 其纯化（6）透析将细胞色素C装入透析袋，用2mL蒸馏水洗涤离心管，一并转入透析 袋，在500m1烧杯，电磁搅拌器搅拌，15分钟换水一次，换水34 次后；检查透析外液SO
6、42-是否已被除净（方法：取2m1 BaCl2溶液 于试管中，滴加2至3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示 SO42-未除净，反之，说明透析完全）将透析液过滤，即得细胞色素 C制品分离和浓缩细胞色素C2.细胞色素C含量的测定: 根据还原型细胞色素C水溶液在波长520nm处有最大光吸收这一特性，作出细胞色素C浓度和光吸收值标准曲线，然后根据所测定的光吸收值，由标准曲线的斜率来求得所测样品的含量。具体操作如下：标准曲线的绘制配制细胞色素C标准母液（3.24mg/mL）。按下表配制标准样品的浓度梯度，再在各管中加入3mL的水，混 匀，以0号管做空白对照，在520nm波长处测得各管的光吸收值（A
7、520nm），如图：管号012345CytC母液(3.24mg/mL) (mL)00.050.100.200.300.40蒸馏水（mL）1.000.950.900.800.700.60CytC 浓度(mg/mL)00.1620.3240.6480.9721.296光吸收值（A520nm）0.0000.0250.0630.1010.1720.212细胞色素C光吸收值与浓度关系的标准曲线细胞色素衩度tmg/mL)(2)样品测定取纯化后的细胞色素C液1mL加水3mL,混匀，测A520nm。如果光吸收值不在标准曲线范围内(00.30), 应用水稀释适当倍数后，重复上步的操作，然后换算。五、结果计算:实
8、验中测得的细胞色素C的光吸收值为：A520nm=0.266按照老师的计算公式(y=0.1675x):样品浓度=1.588mg/mL我得到的吸光度与浓度换算公式(y=0.166x+0.0014):样品浓度=1.594mg/mL原因：可能是所用软件运用不同的算法造成的误差。细胞色素C的含量=细胞色素C的浓度X稀释倍数X终体积=0.266X1X5.40=1.44mg六、思考题：1、制备细胞色素C通常选取什么动物组织？为什么？答：采取动物的心脏或着酵母；因为细胞色素C是呼吸链中极重要的电子载体，主要存在于线粒体中，动 物的心脏需氧量较大，因此细胞色素C含量也较大。2、本实验采用的酸溶液提取，人造沸石吸
9、附，硫酸铵溶液洗脱，三氯醋酸沉淀等步骤制备细胞色素及含 量测定，各是根据什么原理？答：酸溶液提取：细胞色素C易溶于水和酸性溶液；人造沸石吸附：物理吸附，沸石的多孔结构能够吸附溶解的细胞色素C；硫酸铉洗脱：(未有明确答案，待询问老师)三氯乙酸沉淀：低浓度的三氯乙酸可使细胞色素C产生可逆变性沉淀，通过离心可将其分离，加入清水后又可复性。3、试以细胞色素C的制备为例，总结蛋白质制备的步骤和方法。答：步骤：从组织中初步提取一分离纯化一检测提取：组织研磨、细胞破碎等；分离纯化：层析、过滤、离心、洗脱、沉淀等；检测：吸光光度法、电泳。4、在本次实验中如何确定称取一定量的沸石上柱？答：根据玻璃柱的直径大小以及2/3长度，计算出所需沸石的体积，再根据沸石的密度，即可算出所需沸 石的重量，用天平称取即可。六、实验注意事项及遇到的问题(1) 注意事项：1) 提取、中和步骤要注意调节PH。吸附、洗脱步骤应严格控制流速；2) 盐析时，硫酸铵应多次少量加入，边加边搅拌；3) 逐滴加入硫酸铵，摇匀，尽快离心，长时间会导致细胞色素C永久变性。(2) 问题：1)在调节PH时很难调节到所需PH，在试验中曾经加入大量酸后没有见精确PH试纸显示相应的PH，用普 通PH试纸则显示过酸，当加入碱后，也没有显示出相应的PH，在本次实验中，我们组调节的PH没有达到 预期的效果，没有精确到要求，且导致肉糜的颜色较黯淡。
