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1、引物设计原则（汇总）一般引物设计（合用于从载体上扩增模板）:1.一般引物长度一般在2-30bp之间，常用28bp左右以保证基因特异性；.下载基因序列到etorNTI;3找到所需安装载体序列；4将基因序列的CS高亮标记;5.寻找载体序列中常用酶切位点，一般为EcoRI、BamHI、inIII、oI等等，比对检测基因序列中与否有这些位点，有的话舍弃,最后选择两个酶切位点,最佳离得远一点，并且最佳ue用同样的。酶切位点一般是6p的回文序列;6.从基因T开始往后选择-20均可（我的习惯是7-6b酶切位点2b保护碱基xbp补齐序列),但最佳保证最后两个是G或者,以减少错配率;7.将上游酶切位点序列补在A
2、G前方,并根据载体对框状况补足两者之间的空缺，再根据序列的GC含量和T值在酶切位点前补足保护碱基,以保证GC和T的含量不能过高。注意，所有的补齐不能用到终结密码子;检测上游序列的构造状况,理论上不要太多二级构造以及端匹配即可;但是反复的序列也不能太多,以免移码;9.从下游终结密码子开始向前选择10-2p均可，但最佳保证最后两个是或者C，以减少错配率；10.选择copmentaryeqc,在N端补齐下游酶切位点,如果tag在C端（即下游），则在第点中应当从终结密码子前开始选择（即舍弃终结密码子)，并且下游引物也要对框,如果tag在N端，则下游引物不需要对框，只要在N端加上下游酶切位点,再根据状况
3、加上2个保护碱基，然后检测二级构造，原则上端部匹配即可。但是反复的序列也不能太多，以免移码;11.将设计好的上下游引物放在一起检测二级构造,原则上3端部匹配即可。但是反复的序列也不能太多，以免移码;12最后在NCI的rirt网站上比对引物序列，看与否基因特异性的。10月18日左洁1. 引物的长度一般为15-30 p,常用的是18-2bp,但不应不小于3，由于过长会导致其延伸温度不小于7，不适于TqNA聚合酶进行反映。. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，特别是端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端浮现3个以上的持续碱基,如GG或CCC，也会使错误引起机率增长。3.引物3端的末位碱基对
4、Taq酶的N合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A的错配效率明显高于其她个碱 基，因此应当避免在引物的3端使用碱基。此外，引物二聚体或发夹构造也也许导致CR反映失败。5端序列对PC影响不太大，因此常用来引进修饰位 点或标记物。4 引物序列的C含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引起反映。上下游引物的C含量不能相差太大。5.引物所相应模板位置序列的m值在72左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种措施，如按公式Tm4(+C)（T),在Oigo软件中使用的是最邻近法( earet neghbor metd)。6. G值是指D双链形成所需的自由能，该值反
5、映了双链构造内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低(绝对值不超过)，而5端和中间G值相对较高的引物。引物的端的G值过高,容易在错配位点形成双链构造并引起DNA聚合反映。7 引物二聚体及发夹构造的能值过高(超过4.al/mol)易导致产生引物二聚体带，并且减少引物有效浓度而使PCR反映不能正常进行。8对引物的修饰一般是在5端增长酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而拟定。引物序列应当都是写成3方向的，m之间的差别最佳控制在1度之内，此外我觉得扩增长度大某些比较好，50bp左右。要设计引物一方面要找到DA序列的保守区。同步应预测将要扩增的片段单链与否形成二级构造。如这
6、个区域单链能形成二级构造,就要避开它。如这一段不能形成二级构造,那就可以在这一区域设计引物。引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 产物不能形成二级构造。 引物长度一般在13碱基之间。 G+C含量在4060%之间。 碱基要随机分布。 引物自身不能有持续4个碱基的互补。 引物之间不能有持续4个碱基的互补。 引物5端可以修饰。 引物3端不可修饰。引物3端要避开密码子的第3位。1. 引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过7%或有持续8个互补碱基同源。2.避开产物的二级构造区 某些引物无效的重要因素是引物反复区DNA二级构造的影响，选择扩增片段时最佳避开二级构造区域。用有关计算机软件可
7、以预测估计mRNA的稳定二级构造，有助于选择模板。实验表白，待扩区域自由能（）不不小于58lkJ/ol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时,用7dez2 脱氧GT取代dGTP对扩增的成功是有协助的。3.长度 寡核苷酸引物长度为130bp,一般为227er。引物的有效长度:Ln=2（G+C)(A），L值不能不小于38,由于38时,最适延伸温度会超过aDN聚合酶的最适温度(74),不能保证产物的特异性。4.G+C含量G+C含量一般为406%。其m值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下，0寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度,一般高于值 510。若按公式T=4(G+）+2（A+T）估计引
8、物的Tm值,则有效引物的T为50，其T值最佳接近7以使复性条件最佳。5.碱基本随机分布引物中四种碱基的分布最佳是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。特别3端不应超过3个持续的或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引起。6.引物自身 引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状构造牙引物自身复性。这种二级构造会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断,引物自 身持续互补碱基不能不小于3bp。 .引物之间 两引物之间不应不互补性，尤应避免端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个持续碱基的同源性或互补性。 8.引物的3端 引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰
9、。3端也不能有形成任何二级构造也许，除在特殊的PC（ASPCR）反映中，引物3端不能发生错 配。在原则P反映体系中，用2U Tq NA聚合酶和00mol/ dNTP(四种dTP各00l/L）以质粒（13拷贝)为模板，按95,5s；5,2s;7，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下,引物3端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。AA错配使产量下降至1/20,G和CC错七下降至1100。引物A： 模板G与引物G:模板A错配对PC影响是等同的。 9.引物的5端引物的端限定着P产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰涉及:加酶切位点；标记生
10、物素、荧 光、地高辛、3等;引入蛋白质结合DA序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。 1.密码子的简并 如扩增编码区域,引物3端不要终结于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。Hairpn 发卡构造如果自由能值不小于 则该构造不稳定从而不会干扰反映如果自由能值不不小于0则该构造可以干扰反映二聚体可以在序列相似的两条引物或正反向。引物之间形成如果配对区域在3末端问题会更为严重3末端配对很容易引起引物二聚体扩增使Pai Rting 匹配度评分匹配度低的引物对常常不太有效是由于在同样退火温度下Tm低的引物决定扩增的特异性而Tm高的引物更易于形成非特
11、异性结合而导致错误的起始【】引物的长度以1530bp为宜，否则会影响扩增的特异性。【】 】碱基尽量随机分布,避免相似的碱基成串排列，引物的C含量在40-60之间,若G+含量太低，可在端加上某些或,若G含量太高，可在5端加上某些A或。【3】应避免每条引物内部形成二级构造及两条引物的3端互补形成引物二聚体，避免在引物的3端有3个G或3个C成串排列,3端的末位碱基最佳选T、G，而不选,也有建议在引物的两端用-2个嘌呤碱基。【4】尽量使用两条引物的T值相似(最佳相差不要超过),退火温度根据较低的T值选定,也可以通过变化引物的长度来平衡两条引物的退火温度。Tm值可 以根据T=4(+）+2(+T)计算。而
12、对于较长的引物,Tm值需要考虑动力学参数、从“近来邻位”的计算方式得到，既有的PC引物设计软件大 多数都采用这种方式。(注:对于Tm值的计算有争议的地方是附加序列应不应当计算在内，我觉得有值得商讨的地方。由于从理论上只有最开始的循环引物的附加 序列是不与模板链结合的,而在后来的PCR反映中,引物的附加序列是和模板链结合了的。）【5】 引物的3端要与模板严格配对，而5端碱基没有严格的限制，只要与模板DNA结合的部分足够长，其5端碱基可不与模板N配对而呈游离状态，这样， 我们可以在引物的5末端加上酶切位点(引入酶切位点时,要考虑到进行双酶切的共用缓冲液,否则给下游工作带来困难)、启动子,以便下游操
13、作。【6】不要在扩增序列的二级构造区设计引物,以免退火困难。也要考虑引物设计处模板的特异性。引物设计原则1. 引物的长度一般为5-30 b,常用的是18-27 b,但不应不小于3,由于过长会导致其延伸温度不小于74,不适于Taq N聚合酶进行反映。2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，特别是端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物端浮现个以上的持续碱基,如G或CCC，也会使错误引起机率增长。.引物3端的末位碱基对Taq酶的A合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其她3个碱基，因此应当避免在引物的端使用碱基。此外，引物二聚体或发夹构造
14、也也许导致PCR反映失败。5端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。4. 引物序列的GC含量一般为40-6，过高或过低都不利于引起反映。上下游引物的GC含量不能相差太大。5引物所相应模板位置序列的值在7左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种措施，如按公式=4()+2(AT），在ligo软件中使用的是最邻近法（th nrest neighbor mtod)。. G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链构造内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低（绝对值不超过9)，而5端和中间值相对较高的引物。引物的3端的值过高，容易在错配位点形成双链构造并引起DNA聚合反映。. 引物二聚体及发夹构造的能值过高(超过4.5kcl/）易导致产生引物二聚体带，并且减少引物有效浓度而使C反映不能正常进行。8. 对引物的修饰一般是在5端增长酶切位点,应根据下一步实验中要插入产物的载体的相应序列而拟定。引物序列应当都是写成5-3方向的，m之间的差别最佳控制在1度之内,此外我觉得扩增长度大某些比较好,00bp左右。要设计引物一方面要找到DNA序列的保守区
