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1、一、经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的 RNA 电泳这一方法原于 McMaster 和 Carmichael（ 1977 ）。 含有乙二醛 DMSO 的凝胶比含有甲醛的凝胶更 难于进行电泳，因为前者泳动速率较慢而且需将电 泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H+ 梯度。尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率（ Mi ller ，1987 ），但用含有乙二醛 DMSO 的凝胶对 R NA 进行分级离，通常 Northern 杂交所显示的 RN A 条带更为锐利。1、在灭菌的微理离心管内，混匀下列液体：6mol/L 乙二醛 5.4ulDMSO 16.0ul0.1mol/L 磷酸（ pH7.0 ）
2、 3.0ulRNA （多达 10ul ）5.4ul 市售乙二醛通常为 40% 溶液（ 6mol/L ）。由于接触空气的后乙二醛易于氧 化，所以使用前需通过混合床树脂（ Bio-Rad AG 501-X8 对乙三醛溶液进行去离子处理，直至溶液 pH 值大于 5.0 为止，然后可分装在小份，用盖紧 的小管贮存于一20 C。每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液体应予丢弃。 0.1mol/L 磷酸钠（ pH7. 0）的配法如下：将 3.9ml 1mol/L 磷酸二氢钠、 6. 1ml 1mol/L 磷酸氢二钠和 90ml 水混合，用 DEP C 处理上述溶液后高压灭菌。每一泳道至多可分析 10ug RNA
3、 ，通常用 1020 ug 细胞总 RNA 进行 Northern 杂交，可以检测高丰度 mRNA （占 mRN A 总量的 0.1% 以上），如等测 RNA 含量极微，每 个泳道应加 0.5 3.0ug poly （A）+RNA 。2、将微量离心管盖严，将 RNA溶液置于50 C 温育 60 分钟后， 用冰水浴冷却样品， 离心 5 秒钟， 使管内所有液体沉降至管底。3、于50 C温育RNA溶液的同时，灌制琼脂糖 水平凝胶，用 1.4 %琼脂糖分析 1kb 以下的 RNA 样品， 而用 1% 琼脂糖分析 1kb 以上的 RNA 样品。 加入 0.1mmol/L 磷酸钠（ pH7. 0 ）后，升
4、温至 7 0 C, 加入碘乙酸钠固体至终浓度为10mmol/L（使RNA酶失活），再降温至50 C,制胶，加入R NA 样品前一至少放置 30 分钟使其凝固。用于 RN A 电泳的电泳槽需用去污剂溶液洗净，用水冲洗， 用乙醇干燥，然后灌满 3%H2O2，于室温放置10 分钟后， 用经 DEPC 处理的水彻底冲洗电泳槽。 因 乙二醛可与溴化乙锭发生化学反应，所以制胶和电泳过程中诮避免作用溴化乙锭4、将RNA样品冷却至0 C,加入4ul灭菌的并 经用 DEPC 处理的戊二醛 -DMSO 凝胶中样缓冲 液，随后立即将上述样品加至凝胶加样孔。用已知 大小的乙醛酰 RNA 作为分子量标准参照物， 如用
5、1 8S 和 28S rRNA 或 9S 兔珠蛋白 mRNA ，上述 RNA 长度分别为 6322 、 2366 和 710 个碱基。也 可以从 BRL 购置已知大小的 RNA 混合物作为分子 量标准照物。通常分子量标准参照物的泳道位于凝 胶边缘，便于电泳后将其切去进行溴化乙锭染色， 可能的话应在分子量标准参照物以及欲转移至硝 酸纤维素滤膜或尼龙膜的样品之间留空一个泳道。乙二醛 -DMSO 凝胶加样缓冲液50% 甘油10mmol/L 磷酸钠（ pH7.0 ）0.25% 溴酚蓝0.25% 二甲苯青 FF5 、将凝胶浸入 10mmol/L 磷酸钠电泳液中， 以 3 -4V/cm 电压降进行电泳，
6、同时按图 7.1 对磷酸钠容 液时行持续再循环，使溶液 pH 值维持在可被接受的限度 内（ pH8.0 时乙二醛将从 PNA 分子上解 离）。另一方法为电泳时每 30 分钟换一次磷酸钠缓 冲液。6、电泳结束后 （溴酚蓝迁移出区 8cm ），切下分 子量标准参照物的凝胶条，浸入溴化忆锭溶液（ 0. 5ug/ml ，用 0.1mol/L 乙酸铵配制）中染色 30-45 分钟。 在凝胶放置一透明迟，在紫外灯下照片上每个 RN A 条带至加样孔的距离，以 RPN 片段大小的 lg 对 数值对 RNA 条带的迁移距离作图，用所得曲线计 算从凝胶移到固相支持体后通过杂交检出的 RNA 分子的大小。7 、R
7、NA 从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，将RNA 转移至尼龙膜。二、将变性 RNA 转移至硝酸纤维素滤膜 电泳完毕后，可立即将乙醛酰 RNA 自琼脂糖凝 胶转移至硝酸纤维素滤膜，有以下几种转移方法： 毛细管洗脱法、真空转移法和电印迹法。毛细管洗 脱法如下所述， 真空转移法和印迹法则按有关仪 器生产厂家产品说明书进行。尽管有人认为在转移前对琼脂糖凝胶进行预处理实属不必 （ Thomas ，1 980 ）甚至有害（ Thomas ，1983 ）。但我们认为含甲醛的凝胶必须用经 DEPC 处理 的水淋洗数次，除去甲醛。如果琼脂糖中浓度大于 1% 或凝胶厚度大于 0.5cm 或待分析的 RNA 大于 2.
8、5kb ，需用 0.05mol/L 氢氧化纳浸泡凝胶 20 分钟。 然后在凝胶上放置硝酸纤维素凝膜或尼龙膜， RN A 随向上迁移的缓冲液转移至固相支持体（硝酸纤 维素滤膜或尼龙膜）上。1、将凝胶移至一个玻璃皿内，用锋利刀片修凝 胶的无用部分，在凝胶左上角（加样孔一端为上） 切去一角，以作为下列操作过程中凝胶方位的标 记。2 、用长和宽均大于凝胶的一块 Plexiglas 有机玻 璃或一叠玻璃板作为平台，将其放入大千烤皿内， 上面放一张 Whatman 3MM 滤纸，倒入 20xSSC 使液面略低于平台表面，当平上方的 3MM 滤纸温 透后，用玻棒赶出所有的气泡。3、用一把新的解剖刀或切纸刀裁
9、一张硝酸纤维 素滤膜（ Schleicher &Schuell BA85 或与之相当的 产品）。滤膜的长度和宽度应分别比凝胶大 1mm ，接触滤膜时须戴手套或用平头镊子（例如 Millipor e 镊子），用有油腻的手接触过的硝酸纤维素滤膜不 易浸温。4、将硝酸纤维素滤膜浮在去离子水表面，直至 滤膜从下向上湿透为止， 随后用 20xSSC 浸泡滤膜 至少 5 分钟，用干净的解剖刀片切去滤膜一角，使 其与凝胶的切角相对应。不同批号的硝酸纤维膜， 其浸湿速率相差悬殊。如滤膜池浮在水面上几分钟 后仍未湿透，应另换一张新滤膜，因为未均匀浸湿 的滤膜进行 RNA 转移是靠不住的。这种滤膜也不 必丢弃，可
10、将其夹在用 2xSSC 浸湿的 3MM 滤纸中 间，高压 5 分钟。通常上述处理足以使硝酸纤维素 滤膜湿透。高压处理的滤膜应夹在经过高压理理并 用 2xSSC 浸湿的 3MM 滤纸中间， 装入塑料袋， 密 圭寸后于4 C保存备用。5 、将凝胶翻转后置于平台上温润的 3MM 滤纸中 央， 3MM 滤纸和凝胶这间不能滞留气泡。6 、用 Saran 包装膜或 Parafilm 膜围绕凝胶周边， 但不是覆盖凝胶， 以此作为屏障，阻止液体自液 池直接流至凝胶上方的纸巾层中。并非堆放得十分 整齐的纸巾，易于从凝胶的边缘垂下并与平台接触，这种液流的短路是导致凝胶中的 RNA 的转移 效率下降的主要原因。7、
11、在凝胶上方放置温润的硝酸纤维素滤膜，并 使两者的切角相重叠。滤膜的一条边缘应刚好超过 凝胶上部加样孔一线的边缘。滤膜置于凝胶表面适 当位置后，就不应轻易移动，滤膜与凝交之间不应 留有气泡。8 、用 2xSSC 溶液浸湿两张与凝胶同样大小的 3 MM 滤纸， 温润的放置在湿润的硝酸纤维滤膜上 方。用玻璃棒赶出其间滞留的气泡。9、切一叠（5-8cm高）略小于3MM滤纸的纸巾， 将其放置在 3MM 滤纸的上方。并在纸巾上方放一 块越境玻璃板，然后用 -500g 的重物压实。其目的 是建立液体自液池经凝胶向硝酸纤维素滤膜的上 行流路，以洗脱凝胶中的 RNA 并使其聚集在硝酸 纤维素滤膜上。10 、使上
12、述 RNA 转移持续进行 6-18 小时，每当 纸巾浸湿后，应换凝的纸巾。11、转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸，翻转凝胶和硝酸纤维素滤膜，以凝胶的一面在上，置于一张干的 3MM 滤约纸上，用一支极软 铅笔或圆珠笔，在滤膜上标记凝胶加样孔的位置。12 、从硝酸纤维素滤膜上剥离凝胶弃之。以 6x SSC 溶液于室温浸泡滤膜 5 分钟，这一步可以除去 粘着在滤膜上的琼脂糖碎片。从 6xSSC 溶液中取 出滤膜，将滤膜上的溶液滴尽后平放在一张纸巾 上。于室温晾干 30 分钟以上。 为估计 RNA 的转移 效率， 可将胶置于溴化乙锭溶液 ( 0. 5 ug/ml ， 以 0.1mol/L 乙
13、酸铵配制)中染色 45 分钟，于紫外 灯下观察。13 、将晾干的滤膜放在两经张 3MM 滤纸中间， 用真空炉于 80 C干烤0.5-2小时。如干烤时间过 长，滤膜极易脆裂并可能发黄。如果滤膜并不立即 用于杂交实验，可用铝箔宽松地包裹起来，在真空 下贮存于室温。14 、仅适用于滤膜上含有乙醛酰 PNA 的情况： 杂交前需用 20mmol/L Tris-CI (pH8.0 )于 65 C洗 膜，除去 RNA 上的乙二醛分子。三、转移至硝酸纤维素滤膜前后进行的 RNA 染当 RNA 自琼糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜之 前，溴化乙锭的染色时间一般不宜过长，这是因为 被染料饱和的核酸分子，其转移效率有所降
14、低。然 而，用溴化乙锭作短暂染色，既不至于对核酸转移 过程产生可以察觉的掏作用，又独具同时检测凝胶 和凝膜上的 RNA 的优点。（一）方法 I1 、电泳结束后， 含乙二醛 -DMSO 的凝胶应浸入 含溴化乙锭（ 0.5 ug/ml ）的 10mmol/L 磷酸钠（ p H7.0 ）溶液。甲醛凝胶需用无 RNA 酶的水淋洗， 用 20xSSC 溶液浸泡，随后用含溴化乙锭（ 0.5ug/ ml ）的 20xSSC 溶液染色。2 、于室温染色 5-10 分钟，在紫外灯下观察，照 像。3 、按前所述方法， 将凝胶中的 RNA 转移至硝 酸纤维素滤膜，转移后能常在学光下也可看出已染 色的 RNA 条带。
15、这种方法仅适用于每一泳道均含有相当大量 （如5ug 以上）的 RNA 的情况。（二）方法u硝酸纤维素滤膜上的 RNA 也可以用下述方法染 色：从干烤后的硝酸纤维素滤膜上剪下所需的条带 进行染色， 也可以用经过杂交并经 X 光片曝光后的 整张滤膜进行染色（ A.Efstratiadis ，未了表材料） 。1）将干燥的滤膜浸入 5%冰乙酸中， 于室温浸泡 15 分钟。2）再将滤膜转移至 0.5mol/L 乙酸钠（ pH5.2 ）、 0.04% 亚甲蓝溶液中， 于室温浸泡 5-10 分钟。3 ）用水淋洗滤膜 5-10 分钟后，可见 RNA 分子 量标准参照物带型锐利而 poly （ A） +mRNA
16、 为一 模糊带型，由许多长度范围从 500 碱基以下至 5kb 以上的各种 mRNA 共同组成， mRNA 的平均长度 约为 2kb 。四、杂交和放射自显影固定于滤膜上的 RNA 的预杂交、杂胶及淋洗等 条件，与 DNA 杂交的相应条件基本相同。现简述 如下：1 、用下列两种溶液之一进行预杂交，时间1-2小时。若于42 C进行，应采用：50% 甲酰胺5xSSPE2xDenhardt 试剂0.1%SDS若于68 C进行，应采用：6xSSC2xDenhardt 试剂0.1%SDS2 、在预杂交液中加入变性的放射性标记探针， 如欲检测低丰度 mRNA ， 所用探针的量至少为 0. lug，其放射性比活度应大于 2x108计数/ （分？ug） 在适宜的温度条件下继续温育 16-24 小
