完整版酵母细胞

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1、酵母细胞表面展示技术是一种真核蛋白表达系统。 其基本原理是将外源靶蛋白基因与特定的 载体基因序列融合后导入酵母细胞， 融合蛋白诱导表达后， 信号肽引导融合蛋白向细胞外分 泌，外源蛋白的展示主要是借助于GPI锚的作用，GPI锚定蛋白的C端包含疏水多肽，当细胞蛋白被合成， 前体蛋白通过羧基末端的疏水序列锚定在内质网膜上， 其余蛋白则位于内质 网腔中。在极短的时间内，疏水序列在转酰氨基酶的作用下3位点裂开同时被 GPI锚置换，并被运输到高尔基体再通过分泌途径分泌至细胞膜外。 在蛋白水解酶作用下， 分泌信号序列 被切除，细胞蛋白被磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C从细胞膜上释放并以 GPI锚定形式与葡聚糖共价相

2、连被转运至细胞壁外。图1展示的是通过 a-凝集素系统转运目的蛋白到细胞表面的分泌途径。 酵母表面展示技术具有表达偏差小， 展示的融合蛋白相对分子质量范围大， 分 子数量多，筛选、纯化、活性测定方便等优点。目前， 最常见的酵母表面展示系统包括： 凝集素展示表达和絮凝素展示表达 5。如图 2 所示，a -凝集素展示表达系统（图2A）是将外源基因与酵母编码a-凝集素C端编码序列连接后插入质粒载体的分泌信号肽（Secretion signal, SS下游，融合蛋白诱导表达后，信号肽引导嵌合蛋白向细胞外分泌，由于融合蛋白C-末端存在含GPI锚定信号（GPIanchor attachment signal

3、）的凝集素多肽序列，可将蛋白锚定在酵母细胞壁上，从而将蛋白分子展示表达在酵母细胞表面；a-凝集素展示系统（图2B）与a-凝集素展示系统不同的是其具有由二硫键连接的 Aga1和Aga2两个亚基，目的蛋白通过与Aga2形成融合蛋白，再通过Aga1末端的GPI结构使目的蛋白表达于细胞表面；絮凝素展示表达系统利用絮凝素基因（flolp）与外源基因融合，并将融合蛋白展示表达在细胞表面，此系统又包括两个子系统：GPI锚定系统（图2C）和絮凝结构域 （Flo1p flocculation functional domain） 锚定系统 （图 2D）。 GPI 锚定系统是利用絮凝素 Flo1p的C末端含有的G

4、PI结构锚定外源蛋白，此系统与a-凝集素展示相似；絮凝结构域锚定系统是利用 Flo1p 的中间絮凝功能结构域与外源蛋白融合， 通过絮凝功能结构域识别酵 母细胞壁中的甘露聚糖链并通过非共价作用诱导细胞粘附、 聚集成可逆性絮状物。 进而使外 源蛋白表达于酵母细胞表面。近年来， S.cerevisiae 细胞表面展示技术迅速发展并在多个领域得到应用， 展现出广阔的 发展前景。可通过使外源蛋白固定化于 S.cerevisiae 细胞表面，从而生产微生物细胞表面蛋 白，包括淀粉酶、 纤维素酶等在生物乙醇生产中起关键作用的酶蛋白， 从而使酵母表面展示 技术在生物乙醇生产应用中不断发展与完善， 本文着重介绍

5、了近年来酵母细胞表面工程在生 物乙醇菌种开发中的应用与研究进展。1 酵母细胞表面技术展示淀粉分解酶以淀粉类生物质为主要成分的蔗糖和糖蜜可以实现大规模的乙醇生产，然而， 以淀粉为原料生产生物乙醇要经历多步反应而且生产成本偏高。 导致成本偏高的原因主要有两个： 一 是由于 S.cerevisiae 不能直接利用淀粉类物质，因此在发酵过程中需要额外添加大量的葡糖 淀粉酶（Glucoamylase）和a-淀粉酶（aAmylase）;二是为获得较高的乙醇产量，首先要将淀粉在140C180C的高温下进行糊化，而这也就增加了能耗。为此，大量的研究集中尝试在 S.cerevisiae 细胞表面展示淀粉分解酶，

6、 从而实现以淀粉类物质为底物的大规模乙醇生产， 并取得了一定的成果。利用细胞表面展示技术构建能利用淀粉的全细胞催化剂， 可将编码淀粉酶的外源基因导 入酵母细胞内使其能够分泌淀粉酶7 。已经构建好的质粒 pGA11 带有编码米根霉 Rhizopusoryzae 的葡糖淀粉酶基因， 转化子细胞能够在以 1可溶性淀粉为唯一碳源的培养基中迅速 生长并产生乙醇，葡糖淀粉酶活力稳定至少100h ，而且所表达的酶，其酶学性质与天然酶相当 8。Murai 等 9是研究细胞表面表达淀粉酶工作的先驱，他们创造性地通过在S.cerevisiae细胞表面展示淀粉酶来开发重组酿酒酵母的研究策略，构建了带有 S.cere

7、visiae MT8-1 的 GAPDH启动子及含有信号肽和glucoamylase/ a凝集素融合基因的载体，glucoamylase来自于R.oryzae,能有效切割淀粉 a-1,4和a-1,6糖苷键。随后，Kondo10等在具絮凝功能特 性的酵母细胞表面展示了葡糖淀粉酶， 他们的工作表明， 展示在细胞表面的葡糖淀粉酶对酵 母的正常生长及乙醇产生无任何影响；厌氧发酵150h后乙醇浓度达到2030g/L。但Kondo等构建的展示葡糖淀粉酶的重组絮凝酵母在发酵300h 的情况下还能保持较高的乙醇产率(0.60.7g/(L h)1(同时”发酵培养基中低浓度的葡萄糖对减少污染也极为有利。展现了在S

8、.cerevisiae 细胞表面展示淀粉酶的优越性。在批式补料发酵过程中，由于缺少溶解酶一一a -淀粉酶，单一展示葡糖淀粉酶的酵母菌株在发酵过程中会有不溶性淀粉的积累。 为克服这一问题，Shigechi 等11-14 构建了共展示来自 R.oryzae 的 glucoamylase 和来自嗜热脂肪芽胞杆菌Bacillus stearothermophilus 的 a-amylase 基因，并以可溶性淀粉为底物，进行补料批式发酵。结果表明，将淀粉颗粒处理到 与酵母细胞大小相近时可极大程度地提高乙醇产率，发酵100h后乙醇浓度达到 60g/L，而且共展示葡糖淀粉酶和a-淀粉酶菌株的絮凝能力与只展示

9、葡糖淀粉酶的菌株基本相同，发酵过程中酵母絮凝能力并不发生改变。在后续的研究中，Shigechi 等14构建了含有葡糖淀粉酶结合结构域(SBD)突变子的酵母展示株系，结果发现，带有突变子SBD葡萄淀粉酶的菌株较野生型菌株的淀粉降解能力提高 1.4倍。Shigechi等13又利用低温糊化的淀粉(80) C取代可溶性淀粉作为唯一碳源进行乙醇发 酵，结果表明：共展示葡糖淀粉酶和a-淀粉酶的菌株与单展示葡糖淀粉酶的菌株相比，乙醇产率明显增加，尤其是共展示菌能更快速地产生乙醇且无延滞期，说明随机水解淀粉a-1,4糖苷键的a-淀粉酶在淀粉水解过程中起关键作用。比较共展示两种淀粉酶的菌株在低温和高温糊化情况下

10、的发酵效率， 无论是最大乙醇浓度、 乙醇产率还是底物消耗率， 两种发酵 系统都基本相同， 乙醇产量为 0.5g/g ，相当于理论值的 97.2。更好地说明了共展示两种淀 粉酶菌株的优势。从牛链球菌 Streptococcus bovis 中分离的淀粉酶为生料淀粉的高效水解提供了新的研 究思路15。Shigechi等12分别以a-凝集素和絮凝素为基础，共展示来自R.oryzae的葡糖淀粉酶和来自S.bovis148的a-淀粉酶，并以生料淀粉为底物进行发酵试验，结果表明a-淀粉酶活性依赖于锚定蛋白，而葡糖淀粉酶活性则独立于锚定蛋白；对于a-淀粉酶活性，以絮凝素系统为基础构建的菌株要比以凝集素为基础

11、构建的菌株酶活性高40 倍。目前已经报道了一些a-淀粉酶具有结合生料淀粉的能力，且降解淀粉的区域位于C-末端16。以a-凝集素为基础的共展示菌能以生料淀粉为原料生产乙醇17-19。另一方面，基于a-凝集素和絮凝素Flolp共展示的葡糖淀粉酶和a-淀粉酶在生料发酵过程中不需要额外添加淀粉酶，在发酵过程中， 淀粉浓度迅速下降， 72h 乙醇浓度达到 61 .8g/L ，乙醇产量为 0.44g/L ， 相当于理论值的 86.5。利用酵母细胞表面展示技术从最初的单展示葡糖淀粉酶到共展示葡糖淀粉酶和a -淀粉 酶，均取得了较好的成果， 为利用淀粉类物质实现大规模乙醇生产提供了新的思路。 不过随 着生物乙

12、醇生产技术的不断发展， 人们开始着眼于利用木质纤维素生产燃料乙醇， 从而避免 了第一代生物乙醇存在的与人争粮的缺陷。2 酵母细胞表面技术与第二代生物乙醇由于第一代生物乙醇的生产存在着与人争粮、 与粮争地的缺陷， 发展第二代生物燃料是 人们面对能源、 环境与粮食问题所采取的积极措施。 利用丰富廉价的可再生木质纤维素生产 乙醇， 是规模化发展车用燃料乙醇的基础。 木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源， 占地 球总生物量的 40左右，高效、廉价地利用木质纤维素转化为如燃料乙醇等化工产品，是 由石油基向生物基经济社会过渡的基础。为此大量的研究开始转向展示纤维素分解酶、 木糖代谢酶等， 从而实现新的突破

13、与尝试， 为实现第二代生物燃料的开发与利用提供了一定的理论依据。2.1 展示纤维素分解酶在纤维素乙醇生产经历的糖化步骤形成葡萄糖的过程中， S.cerevisiae 不能直接利用纤 维素类物质，因此在 S.cerevisiae 中稳定表达纤维素酶是降低生产成本的有效方法。基于a-凝集素 C 端构建的 pCMC11 含有来自棘孢曲霉 Aspergillusaculeatus 的内切羧甲基纤维素酶 CMCase）编码基因，Murai等20通过一系列方法证明了cmcase基因成功地锚定在细胞表面，内切羧甲基纤维素酶活性稳定至少120h。当pCMC11和含有3-bgl1的载体（PBG211）共表达时，

14、 可以快速地将纤维低聚糖转化为葡萄糖， 从而显著地提高了利用纤维素的效率。 目 前已报道了很多在 S.cerevisiae 中表达多种纤维素酶基因和能够糖化可溶性纤维寡糖的重组 酿酒酵母 21-22 。Fujita等同样基于a-凝集素系统在S.cerevisiae细胞表面展示来自丝状真菌里氏木霉Trichoderma reesei的内切葡聚糖酶n的融合蛋白，酵母菌株能明显提高对大麦伕葡聚糖的水解能力；随后，构建了共表达内切葡聚糖酶n和来自A.aculeatus的伕葡糖苷酶I的酵母株系，这种酵母能在以大麦3-葡聚糖为唯一碳源的培养基上生长，在50h内将3-葡聚糖发酵生成乙醇，乙醇产量为0.48g

15、/g，相当于理论值的93.3%，且发酵培养基中的3-葡聚糖能在酵母细胞表面连续水解为葡萄糖，在胞内酶的作用下，立即被利用，转变为乙醇。同时， 酵母细胞的酶活测定结果和流式细胞计数分析结果表明：共展示菌中内切葡聚糖酶n和3-葡糖苷酶I分子的数量大于单展示菌中内切葡聚糖酶n或3-葡糖苷酶I分子数的总和23。其后，Fujita研究小组24将来自T.reesei的纤维二糖水解酶n也增加到展示系统中，从而使酵母细胞真正具有水解无定形纤维素能力， 同步糖化发酵生成乙醇， 结果显示共展示内切葡 聚糖酶n和纤维二糖水解酶n的菌株比只展示内切葡聚糖酶n的菌株对无定形纤维素的水 解能力高，且主要产物是纤维二糖，单展示纤维二糖水解酶n的菌株主要产物是少量的纤维 二糖，单展示内切葡聚糖酶n的菌株主要产物是纤维二糖、纤维三糖，而共展示3 -葡糖苷酶 i和内切葡聚糖酶n的菌株无乙醇产生。在以葡萄糖为碳源的培养基里，虽然在 40h 内所有无定形纤维素不能被完全利用，但 其发酵能力也达到 10g/L 纤维素可产生 3g/L 的酒精。即每克碳水化合物可产 0.45g/g 酒精， 相当于理论值的 88.5，可他们并没有报道在纤维素为唯一碳源的条件下该酵母的发酵能 力。Shuhei等25以共展示三种纤维素酶的重组酵母（内切葡聚糖酶n、纤维二糖水解酶n