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1、RNA提取及逆转录步骤组织RNA提取：1、将标本约100mg放入研钵，立即加入液氮，研碎后，立即加入 TRIZOL 1mL,研磨10min（清亮）后，转入1.5ml EP管，上下颠倒10次，室温静置 5min。标本为组织时，12000转离心10min取上清，转下步。2、每加入1ml TRIZOL在EP管中加入氯仿0.2mL,震荡15s后，静置5min， 然后12000转离心15mi n。3、将上层水相移入另一 EP管中（宁缺毋滥），并加入约0.5mL异丙醇，震 荡混匀后静置5min， 12000转离心10min.4、弃上清加1mL 75%DEPC乙醇（-20 预冷），漂浮RNA沉淀，（脾脏 需
2、用Tip吹打以去尽杂质），以7500转离心5min。5、弃上清，置于工作台开风机干燥 30min，待RNA沉淀变成半透明时， 加入DEPC水20uL/40uL，如果沉淀不溶解，置于 55-60度温箱水浴5min 左右。-70度保存或立即逆转录。静脉血RNA提取：1、将5mL静脉血于EDTA抗凝管中，放4C冰箱2h左右；2、3000转离心5min，吸取上清置于1.5mL离心管；3、加4mL NS于下层血细胞中，吹打混匀以悬浮细胞；4、 加4mL大鼠淋巴细胞分离液到15mL离心管中，将血细胞悬液缓缓加到 装有大鼠淋巴细胞分离液的离心管中；2000转离心25min;5、小心吸取云雾层（即单个核细胞）
3、，7500转离心5分钟，去上清；6、以1ml NS重悬细胞，吹打洗涤，6500转离心5min，吸尽上清，存于-80C 或加入TRIZOL/裂解液。逆转录步骤（MBI试剂盒）:1、05.mL EP管中加入DEPC 水10uLRNA1uLOligo1uL置于 PCR仪中 70E 5min （编号 XIER101 ）2、放入冰中5min3、点离5秒，加入5 X缓冲液4uLRnase抑制剂1uLdNTP2uL置于 PCR仪中 37C 5min （编号 XIER102 ）4、加入逆转录酶1uL，用tip头吹打混匀，放入PCR仪中42r 60min, 70C 10min （编号 XIER103 ）,然后-
4、20C保存PCR步骤（25uL体系）：模板1uLSense1uLAnti-sense1uLTaqMIX12.5 uL去离子水加至25uL RNA浓度测定：取1uL RNA原液稀释至250uL，测定其A260和A280的值,般A260/280的比值在1.8-2.0之间满足实验要求RNA原液浓度=A260X稀释倍数（250） 40 （ng/丄）Western blotting、主要试剂的配制（所有单位均为g/mL）丙稀酰胺29g+甲叉双丙稀酰胺1g= 100ml，储于1、丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺 棕色瓶，4 C避光保存。2、10%SDS、10%APS3、Tris-甘氨酸电泳缓冲液30.3gTris,
5、 187.7g甘氨酸，10gSDS,用蒸馏水溶解至1L,得10X缓冲液。4、 转移缓冲液2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.375g SDS 200mL甲醇，定容1L5、 丽春红染液储存液丽春红S 2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g加水至100ml用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。6考马斯亮蓝染色液 1g考马斯亮蓝R-250用250mL的异丙醇搅拌溶解，再 加入100mL的冰醋酸，均匀搅拌，再加入 650mL的去离子水，均匀搅拌。滤纸 过滤后室温保存。7、考马斯亮蓝脱色液醋酸100mL，乙醇50mL，蒸馏水850mL、制胶SDS薰丙师降農羅胶的宥效分H范围蜒性
6、drWffiS/kDfl131210 7,55.01D-4312-6C 20-8036 网IjL V出 丙蜡I用肥双丙第禾胺的分子比是1：魏* A-iO配制Trh甘翼 5DS豪再坤HI啟薇胶电泳积晨胶帛用淳液一一一配常刁迥費頼變胶所冃卷颐矗亦臥”123456BW*1,1Z,11,73.44.1S.5再嫦華良魁仓權（!fl.170 J30.50,670.83l.C】”31,71-0Tris ( PH6-R )0.250.50.630.751.01.1510% SDS山(HO D2D.03Q.040430,06O.GS10幕过黨寵讓（!）O.OL0.020舫0.04战腐0.06O.OfiXITME
7、D 1)O.Q010.002帆0030.004D.OOS0.00ft10012,3in* sos0.05040.150.20.2S030”斗0.Su畀过喷曲馆a0.050 J035DM0.250*30.40.5TEMED (|0.0G30.00&0.Q090.0120.015Q.Olfi0 G240.031,94.05.S7.911,9Li.y19点昶駕丙烯粧胺福合粧1.73.35.06,78.510.0Z16.71.5 itid/L T C pH8 R )ra2-53.45.0A.3T.S10,012.5in% sdsft.050.1nasC.2a. 250.35.4侗轉过曉釀容（!a/i0
8、45Q.25ft.A(J.4(MTEMED !)o.oaia.0040,00&o.oa0.0i0.0120.4U0 4212%t术t.B24.96.66,29.913.Z血秸丙烯Bfc抜推含菽（E2.06 0101201A.020.01-5 moVL Ttib(阳6 启)1.32,5J.85.0心彳210.QL“10% SDSo.os0.1Eh 150.20.25030.40,5tnD.050,10.15040,250.30.40.5TEWED Q.OGZOg0.006(LOOS0.010.012IhOUD.Q3水1.1J,3Xd4+*5.?6.P気21U5如貉丙烯從墙iS合液（!2.55,07,510.012.515.0M-D25.01.5 tiwA/L Tni pH 目冶)1.)2,S38齐&6形7.510,012.J10% SJSn.05fi.lQ,1SOJ0.2S0.30.4G/C.M04*15O,ZQ,Z3a,30.4fl5TEMED 2 (如需抗原修复，可在此步后进行，常 用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液，3g柠檬酸二钠+0.4g柠檬 酸+蒸馏水=1L )。( 4 )5%
