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1、微生物检验规范1.目的明确微生物检验方法和监控标准，规范微生物检验的各项操作，通过对原料、产品及生产线各要求环节进行微生物测试，从检测结果来判定原料、产品及生产线微检监控点的微生物情况是否符合公司和国家规定的标准，确保产品品质。2.适用范围公司所有需要作微生物检验的原料、每批产品及微检监控点。3.职责3.1 品保微生物检验员负责微生物检验实验器材和无菌室的准备工作。3.2品保微生物检验员负责原料和生产线微检监控点的微检样品抽样、保存、登记和微生物检测工作。3.3成品制程人员负责成品微检样品的抽样工作，品保微生物检验员负责成品微检样品的保存、登记和微生物检测工作。3.4品保微生物检验员负责出具检
2、测报告并作出符合性判定。3.5品保科长负责微生物检测报告的审核。4.作业程序4.1实验器材4.1.1 实 验 器 材、培 养 基 和 试 剂 1 超净工作台 2 恒温培养箱 3613 低温培养箱 25-28 4 恒温水浴锅 4615电子/托盘天平（精确到0. 1g） 6 高压蒸汽杀菌锅7 烘箱 8 酒精灯9 记号笔 10打火机 11镊子 12药匙 13. 生物滤膜 14培养皿 9cm/6cm15. 锥形瓶 300ml/500ml+硅橡胶塞 16试管 17小发酵管 18试管架授课：XXX19接种环 20显微镜 21塑料篮子 22移液管 1ml、5ml、10ml 23. 膜过滤设备 24. 医用不
3、锈钢剪刀4.1.2培养基和试剂 1总菌数培养基 平板计数琼脂培养基 2大肠菌群培养基 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、煌绿乳糖胆盐（BGLB）3. 霉菌、酵母菌培养基 虎红培养基4氯化钠6乙醇7二氧化氯粉剂8. 过氧乙酸4.2 微 生 物 检 验 的 前 准 备 4.2.1检验所需器具的灭菌4.2.1.1培养皿及移液管的干热灭菌洁净干燥的培养皿，倒放于专用培养皿铁筒内，洁净干燥的移液管，尖端朝下，置于移液管专用的铁筒内，把铁筒放在烘箱中，于 120干热灭菌120分钟后，调至 160-180干热灭菌120分钟后，关掉烘箱，自然冷却至60以下，方可打开烘箱门取出置无菌室冷却备用。4.2.1.2锥
4、形瓶及移液管的湿热灭菌 洁净的锥形瓶，塞上硅橡胶塞并用牛皮纸包扎好瓶口，洁净的移液管，用牛皮纸包扎完善后，置于蒸汽灭菌锅中，于121湿热灭菌20分钟即可。4.2.1.3镊子、接种环等的火焰灭菌接种环、镊子要在酒精灯上须灼烧过方可使用；稀释操作时试管口应在火焰上方；培养基容器口边在火焰上方。4.2.1.4化学灭菌（75%酒精、10010-6ClO2）无菌超净台，手部及不能加热灭菌的PE或塑胶制品，桌子等需用化学灭菌法；操作台、桌子、凳子、地面在使用完后均用10010-6 ClO2擦洗灭菌。4.2.2培养基及其缓冲稀释液的配制和湿热灭菌授课：XXX4.2.2.1 0.9%生理盐水的配制称取2.25
5、g氯化钠，溶于250ml蒸馏水中，经湿热灭菌即可。4.2.2.2 75%酒精的配制 取375ml无水酒精，则需加水375/0.75-375=125ml 4.2.2.3培养基的配制和灭菌条件测定项目培养基名称培养基量/1000ml蒸馏水杀菌条件菌落总数平板计数培养基23.5g12115分钟大肠菌群结晶紫中性红胆盐琼脂41.5g煮沸灭菌2分钟大肠菌群煌绿乳糖胆盐40g12115分钟霉菌酵母虎红培养基35g12120分钟灭菌完全后的培养基置于461的水浴锅中,待培养基的温度降至461方可用.4.2.2.4 湿热灭菌的步骤：（1）检查蒸压釜中有否足够的水。（2）检查所有载有液体瓶子的螺旋盖（或塞）是否
6、有松动。（3）检查各待灭菌物品是否已用牛皮纸包裹完善。（4）小心地关好杀菌釜的盖/门。除非每个锁都已彻底锁紧，否则不得加压。（5）检查排气道或排气阀是否打开。（6）加热，使所有空气从排气道中随着蒸汽自动排出。蒸汽要猛烈排放2-3min，以保证蒸压釜内冷空气全部排出。关闭通风阀或排气阀。（7）继续加热，至达到预定压力及温度。设备和培养基将在121下维持20min，以进行灭菌。所需压力要连续维持一定时间。（8）所需加热时间一过，停止加热。在排气阀不打开的情况下让压力自动下降到零。否则不要打开蒸压釜。当压力为零时，小心打开排气阀，待蒸气排尽后，打开蒸压釜盖，让它敞开几分钟以泄去多余的热蒸汽，并将釜内
7、原载有的物品充分冷却。 （9）取出釜内原载有培养基或生理盐水的瓶子，将这些瓶子存放在无菌室的传递箱中待之冷却备用。灭菌完成后的培养基，温度降至461方可使用。所有灭菌完成后的物品，在使用前都必须保持包裹完善无破损的状态。4.2.3无菌室及超净台的灭菌授课：XXX4.2.3.1每天实验前、后把无菌室地面及超净台打扫干净，每天用10010-6 ClO2消毒桌面、地面。每月用2%过氧乙酸熏蒸。4.2.3.2实验结束后打开紫外灯对无菌室空间和表面进行杀菌1小时。4.2.3.3实验前，提前1小时打开超净台紫外灯及无菌室紫外灯。关掉紫外灯后，打开无菌室和超净台通风装置，30分钟后，即可进行实验操作。4.3
8、.样品的抽样和判定标准4.3.1实验前应登记样品，给样品编号，记录检验时间、品项、规格、生产日期、批号、检测项目等，并根据样品数来配制培养基。4.3.2样品的抽样和判定标准天然水的产品名，抽样量、检测项目、频率、方法、标准产品品项抽样频率检验项目检验方法检验标准检验时间550ml/1.25L天然水正常：1瓶/2小时/线开（关）机：2瓶/线细菌总数滤膜法50个/100ml恒温室放置2天后检验大肠菌群滤膜法不得检出霉菌酵母滤膜法20个/100ml细菌总数GB-478920个/ml霉菌酵母GB-47895个/ml备注：按抽样频率，检验方法一半采用GB-4789，一半采用滤膜法。4.3.3生产线微检监
9、控点的样品的抽样和判定标准各监控点名，抽样量、检测项目、频率、方法、标准线别监控点检验项目检验方法标准规定检验频率水处理源水菌落总数取合适的稀释倍数做滤膜法监控项目1次/周大肠菌群霉菌酵母砂滤出水，碳罐出水菌落总数取合适的稀释倍数做滤膜法监控项目1次/维护后大肠菌群霉菌酵母授课：XXX精滤出水菌落总数取合适的稀释倍数做滤膜法监控项目1次/天大肠菌群霉菌酵母RO膜系统出水菌落总数滤膜法10cfu/100ml1次/维护后大肠菌群0cfu/100ml霉菌酵母5cfu/100ml精滤UV后出水菌落总数滤膜法50cfu/100ml1次/天大肠菌群0cfu/100ml霉菌酵母50cfu/100ml膜出水、
10、膜产水储罐、兑制水储罐、兑制水UV后、菌落总数滤膜法10cfu/100ml1次/天大肠菌群0cfu/100ml霉菌酵母5cfu/100ml氧化塔出水、洗瓶水菌落总数滤膜法3cfu/100ml1次/天大肠菌群0cfu/100ml霉菌酵母0cfu/100ml水线灌装头（开机前）菌落总数擦拭法2个/每灌装头1次/周授课：XXX霉菌酵母灌装头5个/每灌装头洗瓶头（开机前）2个/每洗瓶头洗瓶头5个/每灌装头封盖头5个/10cm2盖滑槽5个/10cm2拨盖星轮5个/10cm2盖贮存槽5个/10cm2盖斗5个/10cm2盖输送带5个/10cm2洗瓶夹5个/10cm2门内壁20个/10cm2充填槽外壁或顶部2
11、0个/10cm2风送轨道20个/10cm2输送带（接近灌装机）20个/10cm2冲洗后空瓶平均2个/瓶盖下滑道中盖平均2个/盖操作人员手部50个/双手操作人员衣服50个/10cm24.4微生物检测方法 4.4.1滤膜法: 适用于进行滤膜法检测的各种微检样品。4.4.1.1 仪器：冰箱：04；恒温培养箱：361/25-28；恒温水浴锅：461；电子天平：精确至0.1g；灭菌平皿:直径60mm或90mm；膜过滤设备；滤杯；0.45m滤膜；超净工作台；真空泵；高压灭菌锅；灭菌的剪子、镊子、玻璃瓶及其它物品。4.4.1.2试剂与培养基平板计数培养基、虎红培养基、煌绿乳糖胆盐培养基，0.9%生理盐水，1
12、21灭菌20min；结晶紫中性红胆盐琼脂煮沸灭菌2min；75%乙醇；100ppm二氧化氯。授课：XXX4.4.1.3操作步骤:（1）将样品摇匀，取100ml倒入膜过滤装置中，打开抽滤泵，开始抽滤，抽干滤液后关上抽滤泵。（2）将镊子在火焰上灭菌，膜用灭菌过的镊子取下，在火焰旁正面贴于预先制备的培养基平皿中，平板计数琼脂培养基用于培养菌落总数，虎红琼脂培养基用于培养霉菌和酵母菌，VRBA培养基用于培养大肠菌群，膜下避免出现气泡。（3）培养a.菌落总数：倒置于361的恒温箱中，培养48h2h。菌落总数以实际菌数报告之，单位为cfu/100ml或cfu/ml。b.霉菌和酵母菌：倒置于25-28恒温箱
13、中，3d后开始观察，共培养观察5d。菌落总数以实际菌数报告之，单位为cfu/100ml或cfu/ml。c.大肠菌群倒置于361的恒温箱中，培养18h-24h。取出平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，361培养24h48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。大肠菌群平板计数的报告：经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每100ml样品中大肠菌群数。例：在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10/100ml=60cfu/100ml。4.4.2国标法：适用于不能用滤膜法检测的各种微检样品以及规定用国标法检测的样品。4.4.2.1菌落
